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3. Material und Methode
3.1 Materialien
Lösungen und Reagenzien:
Allgemeine Reagenzien
Glycerol (ICN, Aurora, OH, USA)
Glycin Natriumlaurysulfat (SDS)
Tris
Dinatriumhydrogenphosphat Dihydrat (Roth, Karlsruhe, D)
Eisessig
Harnstoff
Methanol
Natriumchlorid
0,2% P-Nitrophenylphosphat (Sigma 104 Phosphatase Substrat)
Ammoniumacetat (Merck, Darmstadt, D)
Ethanol
Isopropanol
Natriumhydrogenkarbonat
Salzsäure, konz.
Diethanolamin (Sigma, Deisenhofen, D)
Freud'sches Adjuvans (kompl./nichtk.)
PMSF Lösungen und Reagenzien (Zellkultur):
Krebspuffer
15,7 mM Na2HPO4,
1,6 mM KH2PO4,
111,2 mM NaCl,
5,4 mM KC1,
1,3 mM MgC1
2,4 mM NaHCO3,
13 mM Glucose,
pH 7,4
PBS (Zellkultur)
140 mM NaCl,
8 mM Na2HPO4,
3 mM KC1,
1,5 mM KH2P04,
pH7,4
Dulbecco's modifiziertes Eagle Medium (Gibco Life Technologies,
Paisley, Schottland, Kat.-Nr.: 52100-013)
Kollagenase B aus Clostridium histolyticum, EC 3.4.24.3. (Boehringer Mannheim, D, Ka.-Nr.: 1088831)
hochschmelzende Agarose SEA KEM (FMC BioProducts Rockland, USA, Biozym, Hess. Oldendorf, D, Kat. Nr.: 50004)
niedrigschmelzende Agarose SEA USA, PLAQUE (FMC BioProducts Rockland, Biozym, Hess,
Oldendorf, D, Kat. Nr.: 50102) Penicillin,
Streptomycin (Gico Life Tehcnologies, Paisley, Schottland, Kat.-Nr.: 15140-114)
Fungizon: Amphotericin B 250 mg/ml (Gibco Life Technologies, Paisley, Schottland, Kat.- Nr.: 15290)
Fötales Kälberserum (PAA, Linz, A, Kat. Nr. : A 1 5-043)
14C-Prolin (NEN, Dreiech, D)
L-Cystein (Sigma, Deisenhofen, D)
Ascorbinsäure (Merck, Darmstadt, D)
ß-Aminopropionitril (Sigma, Deisenhofen, D)
Pyruvat (Fluka, Buchs, CH)
Insulin (bov. Pankreas) (Boehringer, Mannheim, D, Dat.-Nr.:977420)
IGF-I (Boehringer, Mannheim, D)
Storage-puffer 0,4 M NaCl, 100 mM Tris-HCL,
pH 7,4 Lösungen und Reagenzien (alkalische Phosphatase)
Reaktionslösung
0,2% p-Nitrophenylphosphat in Diethanolamin- HCl,
pH 9,8
Stopplösung
2M NaOH,
0,2 mM EDTA
Lösungen und Reagenzien (Elektrophorese, Kollagenanalyse)
40% (w/v) Acrylamid/Bisacrylamid-Stammlösung Acrylamid/Bisacrylamid 37,5:1) (Appligene oncor, Illkirch, F)
Sammelgelpuffer (Stammlösung)
0,5 M Tris, 0,4% SDS, pH 6,8
Trenngelpuffer (Stammlösung)
1,5 M Tris, 0,4% SDS, pH 8,8
Kammerpuffer
25 mM Tris, 0,1% SDS, 0,2 M Glycin
SDS-Probenpuffer:
0,1 M Tris-HCl, pH 6,8 mit 10% (w/v) Glycerol, 2% (w/v) SDS, 0,8 M
Harnstoff, 0,001% (w/v) Bromphenolblau.
Der reduzierende0 Probenpuffer enthielt 5% (v/v)
ß-Mercaptoethanol.
Entfärblösung
10% Methanol, 10% Essigsäure Pepsin (procine)
Coomassie Blue R-250 (Serva, Boehringer Ingelheim Bioproducts Partnership, Heidelberg)
Coomassie Blue-Lösung 0,1% Coomassie in 25% 2-Propanol, 10% Essigsäure
Ammoniumperoxodisulfat
Molekulargewichtsstandard (6,4- 200 kDa) (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)
Plyklonaler Antiköper gegen Kollagen X des Huhns (Von der Mark, 1997)
Sekundärer Antikörper gegen Immunglobulin G des Kaninchens
gekoppelt mit Peroxidase (Kirgegaard & Perry Lab., WAK Chemie, Bad Homburg v.H.)
Chemoluminessenzsystem ECL (Amersham Life Science, Kat.-Nr.: 2106)
4-Chlor-l-Naphtol (Sigma, Deisenhofen, D)
Lösungen und Reagenzien (Elektronmikroskopie):
Fixierlösung
3% Paraformaldehyd,
0,4% Glutaraldehyd,
3,4% 0,1M Natriumcacodylat pH 7,4,
Osmium,
Propylenoxid
3.2 Methoden
3.2.1 Chondrozytenzellkultur
3.2.1.1 Die Isolierung von Chondrozyten aus Rippenknorpel
Der aus der Kinderchirurgie und des Rechtsmedizin erhaltene Rippcnknorpel wurde zweimal in Krebspuffer mit 100 U/ml Penicillin, 100 mg/ml Streptomycin und 2,5 mm/ml Fungizon gewaschen und von Perichondrium und Geweberesten befreit. Anschließend wurde er dreimal in Krebspuffer mit 10 U/ml Penicillin, 100 mg/ml Streptomycin und 2,5 mg/ml Fungizon gewaschen. Der gewaschene Rippenknorpel wurde quer zu seiner Längsachse ca. 0,3 mm dünn geschnitten. Der geschnittene Knorpel wurde über Nacht mit 2 mg/ml bakterieller Kollagenase in DM EM unter Zusatz von 100 U/ml Penicillin, 100 mg/ml Streptomycin und l mM Cystein im Brutschrank (37° C; 5% CO2) verdaut.
Um die Verdauung zu beschleunigen wurden die Zellen durch vorsichtiges Aufsaugen und Zurückpipettieren der Verdauungslösung suspendiert. Die Dauer des Verdauens durch die Kollagenase steigt mit dem Alter des Knorpels an. Nach der Verdauung wurde die entstandene Chondrozytensuspension durch einen 40mm Nylonfilter gegeben, um Gewebereste zurückzuhalten. Zur Vermeidung von Zellverlusten wurde die Petrischale und der Nylonfilter anschießend mit Krebspuffer gespült und die Zellsuspension auf 50 ml aufgefüllt. Sie wurde zentrifugiert ( 600 x g, 5 min, RT) und das Zellpellet erneut in 50 ml Krebspuffer resuspendiert. Insgesamt wurden die Zellen zweimal gewaschen.
Sie wurden schließlich in 10 ml Krebspuffer aufgenommen, die Zellzahl dieser Suspension wurde mit Hilfe einer Neubauer-Kammer im Phasenkontrastmikroskop bestimmt. Die Zellsuspension wurde zentrifugiert, und das Zellpellet wurde anschließend in DMEM so aufgenommen, daß die Zellzahl dieser Einzelzellsuspension auf 4×106 eingestellt wurde.
Diese Zellsuspension wurde weiter für die Agarosesuspensionskulturen verwendet.
3.2.1.2 Die Agarosesuspensionskulturen (Benya und Schaffer, 1982)
Sterile Petrischalen wurden mit einer 1% (w/v) hochschmelzendcn Agarose (in H2O) beschichtet (0,7 ml/ 35 mm Schale). Um die Agaroselösung zu sterilisieren, wurde sie autoklaviert. Dann wurden 700 ml der sterilen Agaroselösung auf dem Schalenboden verteilt. Diese Schicht ließ man bei Raumtemperatur gelieren. Zum Anlegen der Agarosesuspensionskultur wurde die Zellsupension im Verhältnis 1:1 zu einer Mischung aus gleichen Teilen zweifach konzentriertem DMEM und 2%-iger wäßriger Agarose gegeben.
Die Agaroselösung wurde autoklaviert und dann mit dem zweifach konzentrierten Medium gemischt. Zu dieser Mischung wurden die Zellsuspension, die auf die erforderliche Zelldichte eingestellt war, pipettiert. Die Schalen wurden 15 Minuten lang auf eine Wärmeplatte gestellt, um die Agarose vorläufig in flüssigem Zustand zu halten.
Dadurch sedimentieren die Chondrozyten auf die Grenzfläche der beiden Agaroseschichten. So wird die Beobachtung der Zellen im Phasenkontrastmikroskop und die Quantifizierung der Zellzahle ermöglicht. Nach erfolgter Sedimentation der Zellen wurde die flüssige Zell-Agarosemischung im Kühlschrank bei 4°C 10 Minuten lang verfestigt.
Nach dem Gelieren der Agarose wurden die Kulturen im Brutschrank (5% Kohlendioxid, 37° C) inkubiert. Das Kulturmedium wurde auf die Agarosesuspension pipettiert. Als Kulturmedium wurde DMEM verwandt, welches 60 mg/ml ß- Aminopropionitril, 25 mg/ml Ascorbat, l mM Cystein, l mM Pyruvat, 1% (v/v) Penicillin und 1% (v/v) Streptomycin enthielt. Je nach den experimentellen Bedingungen wurden Wachstumsfaktoren, fötales Kälberserum und/oder 15 mM Zinksulfat zugesetzt. Im Abstand von 3 Tagen wurde das Medium ersetzt.
3.2.1.3 Die Bestimmung der Zellvitalität mit Trypanblauausschuß
Für die Bestimmung vitaler Zellen haben wir 100 ml einer 0,5% Trypanblaulösung in PBS zum Kulturmedium pipettiert. Nachdem die Kultur für 20 Minuten im Brutschrank inkubiert worden war, wurde das Medium von der Kultur abgenommen, und die Zahl der Trypanblau negativen Zellen ermittelt.
3.2.1.4 Die Kollagenpräparation aus Knorpelzellkulturen
i) Markierung der Zellen
Die Kulturen wurden in der Regel von 15 Uhr bis 63 Uhr (für 48 Stunden) mit l mCi/ml L-[C14-U]-Prolin metabolisch markiert. Anschließend wurde entweder nur das abgenommene Medium oder die gesamte Kulturschale bei -20° C eingefroren.
ii) Isolierung der Kollagene aus der gesamten Kultur
a) Isolation der nativen Kollagene
Nach dem Auftauen der eingefrorenen Kultur wurde das abgenommene Medium in 2ml-Eppendorfgefäßen zentrifugiert (1000 x g, 15min), um die Agarose vom Medium zu trennen. Das Pellet wurde verworfen, und aus dem Überstand wurden die Kollagene bei einer Konzentration von 4,5 M NaCl ausgefällt. Man gab langsam festes NaCl bis zu einer Konzentration von 4,5 M zu, rührte für 6 Stunden und zentrifugierte (RPM 14000, F2402, 30min, 4° C, 17530g) die präzipitierten Kollagene ab. Der Überstand wurde verworfen. Das Pellet wurde in 300 ml Storage-Puffer (0,4 M NaCl, 0,1 M Tris-HCl, pH 7,4) aufgenommen. Die Kollagene wurden mit 1700 ml Ethanol präzipitiert, abzentrifugiert (F2402, 17530 x g, 20 min, 4° C) und in deionisiertes Wasser aufgenommen. Nach 2 mal wiederholter Ethanolpräzipitation wurden die Kollagene in 100 ml Probenpuffer aufgenommen.
b) Isolation der Pepsin-resistenten Kollagene
Nach dem Auftauen wurde die zellhaltige Niedertemparatur-Agarose von der Hochtemperatur-Agarose getrennt. Die Hochtemperatur-Agarose wurde verworfen. Die Niedcrtemperatur-Agarose wurde in Zentrifugenröhrchen (Beckman) überführt, mit dem Medium der Kulturschale vereinigt und für den limitierten Pepsinverdau mit 5ml einer Pepsinlösung (l mg/ml Pepsin in 0,5 M Essigsäure, 0,4 M NaCl) versetzt. Diese Lösung wurde 72 Stunden bei 4° C gerührt, anschließend mit 500 ml l M Tris-Lösung (ungepuffert) versetzt und mit 10 M NaOH zum Umschlagspunkt von Phenolrot neutralisiert.
Durch Zugabe von festem NaCl wurde eine Konzentration von l M NaCl eingestellt. Diese Lösung wurde zur vollständigen Extraktion der Kollagene bei 4° C über Nacht gerührt und anschließend zur Abtrennung von Zelldebris und Agarose zentrifugiert (JA 20,1, 28980 x g, 4° C, 30 min). Da frühere Studien (Shaffer, 1982; Bruckner et al., 1989) ergeben hatten, daß diese Fraktion kein nachweisbares Kollagen mehr enthält. Das Pellet wurde verworfen, und die Kollagene wurden durch Erhöhen der NaClkonzentration von 4,5 M NaCl ausgefällt. Dazu wurde festes NaCl in die Lösung gegeben (200 mg/ml).
Die Lösung ließ man für 4 Stunden bzw. über Nacht rühren. Die ausgefallenen Kollagene wurden abzentrifugiert (F2402, RPM 14000, 17530 x g, 20 min, 4°C). Das Pellet wurde in 300 μl Storage-Puffer (0,4 M NaCl, 100 mM Tris-HCl, pH 7,4) aufgenommen und in einem 2ml Eppendorf überfuhrt. Die Kollagene wurden mit 1700 μl Ethanol präzipitiert, abzentrifugiert (F2402, 17530 x g, 20 min, 4°C) und das Pellet in bidestilliertcs Wasser aufgenommen. Nach wiederholter Ethanolpräzipitation wurden die Kollagene in 100 μl Probepuffer aufgenommen. Die Kollagene wurden mit 5 μl Mercaptoethanol reduziert.
3.2.1.5 Die Bestimmung der Zellproliferation
Für die Bestimmung der Zellproliferation wurde nach bestimmten Zeitintervallcn dieselbe Stelle der Kulturschale (sichtbar gemacht durch einen kleinen Punkt am Boden der Petrischale) durch ein Phasenkontrastmikroskop vergrößert und fotografiert (Zeiss Axiowert)
10). Die Anzahl der Zellen auf den Aufnahmen (mindestens 100 Zellen) wurden über die ganze Kulturzeit verfolgt und durch Zählen bestimmt.
3.2.1.6 Nachweis der alkalischen Phosphatase
Der Nachweis der alkalischen Phosphatase wurde durch deren Reaktion von mit p- Nitrophenylphosphat erbracht (Bessey et al., 1946). Die Aktivität in den Medienüberständen blieb auch nach längerer Lagerung bei -20° C erhalten. 50 μl Aliquots des Medienüberstands im Eppendorfgefäß wurden mit 450 μl einer Reaktionslösung (0,2% p- Nitrophenylphosphat in Diethanolamin-HCl, pH 9,8) versetzt.
Im Brutschrank wurden die Ansätze bei 37° C für 30 min inkubiert und anschließend mit einer Stopplösung (2M NaOH, 0,2 mM EDTA) versetzt. Bei einer Wellenlänge von l = 405 nm wurde die Extinktion des gelben Reaktionsprodukts (P-Nitrophenol) bestimmt.
3.2.1.7 Elektrophorese, Autoradiographie, Western-Blot
i) Elektrophorese
Die im Probepuffer für 3 min bei 95° C denaturierten Proteine wurden auf Polyacrylamidgradientengelen elektrophoretisch getrennt (Laemmli, 1970). Zur Analyse der Kollagene wurden die Kollagen im Probepuffer (0,8 M Harnstoff, 10% (w/v) Gly-cerol, 2% (w/v) SDS, 0,001% (w/v) Bromphenol Blau, 0,1 M Tris-HCl, pH 6,8) aufgenommen und durch 4,5-15% Polyacrylamidgradientengelen getrennt. Die Anfärbung der Proteine erfolgte in einer wäßrigen Lösung mit 0,1% (w/v) Coomassie Brillant Blue R-250 in 25% (v/v) 2- Propanol, 10% (v/v) Essigsäure, die Entfärbung der Gele erfolgt in 10% (v/v) Essigsäure, 10% (v/v) Methanol.
ii) Autoradiographie (Bonner and Laskey, 1974)
Nach der Färbung mit Coomassieblau wurden die Gele für die Fluorographie vorbereitet, indem sie dreimal für je 15 Minuten in Dimcthylsulfoxid (DMSO) äquilibriert und danach für 2 Stunden in 20% (W/V) Diphenyloxazol (l DPO)/DMSO) getränkt wurden.
Die behandelten Gele wurden ausgiebig gewässert und anschließend ge trocknet.
Die Exposition der Gele erfolgte bei -80° C auf Kodak XAR-5 Röntgenfilmen.
iii) Imiminblot
Die elektrophoretisch aufgetrennten Proteine wurden im Immunblot auf eine Nitrocellulose-Membran elektrotransferiert (Towbin et al., 1979).
Dazu wurden das PA-GEGel und die Nitrocellulosemembran mit Filterpapieren und Schwammtüchern zwischen Gitter geklemmt und in einen Tank zwischen zwei Plattenelektroden getaucht, der mit Blotpuffer (50 mM Tris, 3580 mM Glycin, 0,1% (w/v) SDS, 20% (v/v) Methanol) gefüllt war. Bei einer Spannung von 30V und einer Stromstärke von 490 mA wurden die Proteine für 6 Stunden elektrotransferiert.
Soweit notwendig wurden transferierte Proteine auf der Membran mit 0,1% (w/v) Coomassie Blue R-250 in 40% (v/v) Methanol, 1% (v/v) Eisessig für l Minuten gefärbt und mit 50% (v/v) Methanol entfärbt. Die Blotmembran wurde zur Blockierung unspezifischer Bindungsstellen nach dem Transfer mit 2% Trockenmilchpulver in PBS behandelt und über Nacht bei 4°C unter Schütteln mit dem primären Antikörper in entsprechender Verdünnung in 0,5% Trockenmilchpulver in PBS inkubiert. Die Membran wurde nach mehrfachem Waschen mit PBS mit dem zweiten Antikörper gegen IgG des Kaninchens in 0,5% Trockenmilchpulver in PBS 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Immunreaktive Banden wurden nach intensivem Waschen mit einem Chemolumineszen/system oder unter Verwendung einer Substratlösung aus 0,18 mg/ml 4-Chlor-l-Naphtol und 0,04% H2O2 delektiert.
3.2.1.8 Elektronenmikroskopie
a) Präparation
Für elektronenmikroskopische Untersuchungen wurden die Agarosekulturen folgendermaßen vorbereitet: Ein Stück Kultur, bestehend aus Hoch- und Niedertemperaturagarose, wurde 4 Stunden lang bei 4°C in 3% Glutaraldehyd/ 0,1 M Natriumcacodylat pH 7,4 fixiert. Nach Waschen mit PBS pH 7,4 wurde es für l Stunde bei Raumtemperatur mit Osmium inkubiert und dann in einer aufsteigenden Alkoholreihe entwässert (15 min Leitungswasser, 15 min 70% EtOH, 15 Minuten 90% EtOH, 15 min 96% Ethanol, 2 x 25 min EtOH abs.). Danach wurde das Stück 2×15 min in Propylenoxid gelegt und dann über Nacht bei 4° C in ein Eponpropylenoxid-Gemisch gegeben. Nach Einbettung in Epon (3 Tage im Wärmeschrank bei ca. 65°C zur Polymerisierung) wurden Semidünnschnitte und Ultradünnschnitte am (Ultra)-Mikrotom angefertigt.
b) Elektronenmikroskopische Untersuchungen Das verwendete Transmissionselektronenmikroskop Zeiss EM902 ist ein TEM mit einem zwischen dem ersten und zweiten Projektivlinsensystem integrierten Castaing-Henry- Energiefilter.
Es hat ähnliche Abbildungseigenschaftcn wie ein konventionelles TEM mit den Vorteilen verbesserter Bildkontraste im Abbildungs- und Beugungs-Modus bei der sogenannten zero-loss Filterung. Hierbei wird in Näherung die chromatische Aberration durch Ausfilterung unelastisch gestreuter Elektronen unterdrückt und damit der Kontrast und die laterale Auflösung erhöht. Eine weitere Kontrastierung (z.B. mit Uranylazetat) und damit eine weitere Manipulation des nativen Zustands der Proben war daher nicht mehr notwendig. Parallel zur Morphologie wurde auch die strukturelle Ausprägung und Anordnung der ersten Mineralbildungen durch zero-loss gefilterte Elektronenfeinbereichsbeugung untersucht.
Durch die Tatsache, daß bei elektronenmikroskopischer Beugung eine sehr viel geringere Anzahl periodisch wiederkehrender atomarer Baugruppen im Kristallgitter zur Erzeugung elektronenmikroskopischer Beugungsreflexe gegenüber der Röntgenbeugung ausreicht, und durch 3 Material und Methoden 50 die Erhöhung des Kontrastes aufgrund der zero-loss Filterung, konnte die Anordnung und strukturelle Ausprägung der primären Kristallbildungen bei den Matrix-vesikeln weitgehend geklärt werden. (Mit Dank an Dr. U. Plate für die elektronenmikroskopischen Untersuchungen).
3.2.1.9 Der Gewinn von Osteoblasten-ähnlichen-Zellen
Die primären osteogenen Vorläuferzellen wurden aus Kälberpriost gewonnen. Hierzu wurde das Periostgewebe des Methacarpus frei präpariert und dann vorsichtig von Knochen abgelöst. Schmale Stücke mit einer Fläche von 0,5 x 1cm wurden geschnitten und mit der osteogenen Seite nach unten in Kulturschale (etwa 10 Stück proSchale) verteilt. Die Explantate wurden in DMEM mit 75/L Glutamin, 10% FKS, Penicillin 100 μg/ml, Streptomycin 100 μg/ml, unter Zusatz von 50 μg/ml Betaaminopropionitrite (BAPN), 50 μg/ml Ascorbat, 1 mM Cystein und 1 mM Pyruvat bei 37°C und 5% CO2 kultiviert. Das Medium wurde 1 x pro Wochen gewechselt. Nach 4 Wochen sind Osteoblasten-ähnlichen Zellen aus dem Perioststück ausgewachsen und können für weitere Versuche verwendet werden. Hierzu wurden die Zellen durch Inkubation mit Kollagenase und Tyrode-Lösung abgelöst, gesammelt und mit 500 g/min zentifugiert. Das so gewonnene Zellpellet wurde für weitere Untersuchungen eingesetzt. (Mit Dank an H, P. Wiesmann für den Gewinn der Osteoblasten-ähnlichen Zellen).
3.2.1.10 Die Kultivierung der Osteoblasten-ähnlichen-Zellen in Kollagen I-Gel
Für das Anlegen der Zellkulturen wurde eine Lösung von 5 mg/ml Kollagen I in 10 mM Salzsäure hergestellt. Diese Lösung wurde zur Sterilisation gegen 10 mM HCl mit 0,5% Chloroform dialysiert. Durch häufiges Redialysieren gegen 10 mM HCl wurde das Chloroform entfernt. Die Schalenböden wurden mit einer Trägerschicht bedeckt, die ebenfalls aus einem Kollagen I-Gel bestand. Dazu wurde die Kollagenlösung mit der gleichen Menge zweifach konzentrierten Mediums und einer entsprechenden Menge normalen DMEM gemischt, so daß eine Kollagenkonzentration von 1,2-1,25 mg/ml eingestellt wurde. In die Schalen wurden jeweils etwa 800 μl der Lösung pipettiert. Die Schalen wurden über Nacht im Brutschrank inkubiert, so daß sich ein festes Trägergel bildete.
Zum Anlegen der Kulturen wurde die Kollagenlösung mit der gleichen Menge zweifach konzentrierten DME Mediums gemischt. Dieser Lösung wurde die entsprechende Menge der Zellsuspension zugegeben, so daß die Zellzahl 2×106 Zellen/ml in der fertigen Suspension betrug. In jede Kulturschale wurden 800 μl der Suspension pipettiert. Die Kollagenkonzentration in der Gelmatrix betrug 1,2 oder 1,25 mg/ml. Die Kollagene ließ man im Brutschrank über Nacht zu einem festen Gel erstarren.
3.2.2 Gewebeuntersuchungen
3.2.2.1 Die Isolation von denaturierten Kollagenpolypeptide aus dem Rippenknorpel
2g Rippenknorpel wurde der von Perichondrium und anderem Fremdgewebe befreit, dreimal mit Krebspuffer gewaschen, in 0,3 mm dicke Scheiben geschnitten und in 20 ml 50 mM Tris, 4,5 M Guandinin, 5mM EDTA, 5mM Benzamid, 5mM N-Ethyl-Maleimide, pH 7,4 inkubiert. Danach erfolgt eine Homogenisation mit einem Polytron-Homogenisator.
Die entstehende Suspension wurde in einem 50 ml Falcontube bei 4° C geschüttelt. Nach 24 Stunden Schütteln wurde die Suspension zentrifugiert. Der Überstand der Rohkollagenlösung wurde dreimal gegen das 20-fache Volumen von DEAE-Puffer (2 M Harnstoff, 0,2 M NaCl, 0,1 M Tris-HCl, pH 7,4) dialysiert und anschließend auf 40 ml verdünnt. Nach dem Zentrifugieren (JA 30.50, 15000 rpm, 4° C, 15 min, 27200 x g) wurde 200 μl Kollagenlösung mit 1800 μl Alkohol bei 4°C 3 Stunden präzipitiert, abzentrifugiert (F2402, 17530 x g, 20 min, 4 °C) und das Pellet in bidestilliertes Wasser aufgenommen. Nach wiederholter Ethanolpräzipitation wurden die Kollagene in 100 μl Probepuffer aufgenommen. Die Kollagene wurden mit 5 μl Mecaptoethanol reduziert.
3.2.2.2 Elektronenmikroskopie
Der Knorpel wurde mit Krebspuffer gewaschen und von Perichondrium und Fremdgewebe befreit. Der so erhaltene Knorpel wurde dünn (ca. 0,3 mm) geschnitten und in 3% Glutaraldehyd/ 0,1 M Natriumcacodylat, pH 7,4 fixiert. Die weiteren Schritte erfolgten parallel zur bereits oben beschriebenen Elektronenmikroskopie der Agarosekulturen.
3.2.2.3 Präparation von säurelöslichem Kollagen I aus Kalbshaut
Bei -80 °C gelagerte, fötale Kalbshaut wurde auf Eis gestellt, in 5 cm breite Streifen geschnitten und unter Zugabe von gestoßenem Eis im Fleischwolf zerkleinert.
Die Haut wurde mit kaltem Wasser aufgeschlämmt und anschließend abzentrifugiert (JA 10, 17696 x g, 30 min, 4 °C). Das Pellet (270 g) wurde mit 111 M NaCl, 50 m M Tris-HCl, pH 7,4, 20 mM EDTA, 2 mM N-Ethylmaleinmid durch ein mechanisches Rührwerk extrahiert. Die Extraktionslösung wurde zentrifugiert (JA 10, 17696 x g, 30 min, 4 °C), und der Überstand der Neutralsalzextraktion wurde aufgehoben.
Das Pellet wurde mit 1500 ml 0,5 M Essigsäure versetzt und durch Rühren mit einem mechanischen Rührwerk extrahiert. Durch Zentrifugation (JA 10, 17696 x g, 30 min, 4 °C) wurde säurelösliches Kollagen im Überstand erhalten. Dieser Überstand (1500 ml) wurde durch langsames Einstreuen mit 78,9 g festem NaCl versetzt, sodaß eine Endkonzentration von 0,9 M NaCl erreicht wurde. Die Lösung ließ man zur vollständigen Fällung weitere 6 Stunden bei 4 °C rühren. Diese Lösung wurde zentrifugiert (JA 10, 17696 x g, 30 min 4 °C).
Das Pellet, das die Kollagene I, III und V enthält, wurde mit 3000 ml 0,5 M NaCl, 0,1 M Tris, pH 10,5 versetzt und mit dem Polytron homogenisiert. Das Homogenat wurde durch Zusatz von 2 ml 8 M HCL auf pH 7-8 gebracht und weiter gerührt. Die Lösung wurde zentrifugiert (JA 10, 17696 x g, 30 min, 4 °C).
Der Überstand (315 ml) wurde durch langsames Eintragen von 22,1 g festem NaCl in die Lösung auf eine Konzentration von 1,7 M NaCl gebracht. Die Lösung wurde über Nacht bei 4 °C gerührt, und anschließend wurden weitere 300 ml des Puffers mit 1,7 M NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,4 hinzugefügt. Die Lösung wurde zur Abtrennung von Kollagen III zentrifugiert.
Der Überstand wurde mit 1,7 M NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,4 auf das doppelte Volumen verdünnt und mit Eisessig auf pH 2-3 eingestellt. Die Lösung wurde durch Zentrifugation geklärt (JA 10, 17696 x g, 30 min, 4 °C). Diese Lösung wurde dreimal gegen 210,2 M Essigsäure dialysiert und anschließend lyophilisiert. Aus der Präparation wurden 1,7 g säurelösliches Kollagen I erhalten.
3.2.3 Zink-Bestimmung nach ICP-ms-Methode und DNA Bestimmung
Die aus dem Rippenknorpel isolierten zwei Millionen Zellen wurden erst im deionisiertem Wasser aufgenommen. 100 μl dieser Suspension (entspricht 200 Tausend Zellen) wurden für DNA-Bestimmung und 900 μl für die Bestimmung der Ionenzusammensetzung durch Inductively Coupled Plasma-mass spectrometry (ICP-MS) verwendet. Die ICP-MS hat Dr. Peter Quint in Institut für Medizinische Physik und Biophysik für uns durchgeführt.
3.2.3.1 Fluorimetrische DNA-Bestimmung
Die l00 μl Probe (etwa 200 Tausend Zellen) wurden in 1,4 ml l0 mM Tris/HCl, pH 7,0, 10 mM NaCl aufgenommen. Die Zellen wurden bei -80 °C eingefroren und nach 4 Stunden wieder aufgetaut. Die aufgetauten Zellen wurden noch weiter mit Ultraschall 5 Minuten behandelt und mit 0,2mg Bisbenzimid versetzt.
Je 10 μl der drei DNA-Standard(l) und 10 μl H2O (Leerwert) wurden mit 1,5 ml Farbstofflösung(2)versetzt. Im Fluorimeter wurden nach 5-60 Minuten mit einer Anregungswellenlänge von ca. 365nm die Emissionen der Ansätze im Bereich um 450nm gemessen.
Aus den Emissionen und Konzentrationen der Standards wurde eine Eichkurve erstellt, mit deren Hilfe die Konzentration der Proben ermittelt wurde.
Reagenzien:
1. DNA-Standards: l,5 μg/ml, 1 μg/ml, 0,5 μg/ml
2. Farbstofflösung: 0,2 mg Bisbenzimid (Hoechst 33258)/1 in 10 mM Tris/HCl, pH 7,0, l0 mM NaCl
3. Eichstandard für das Fluorimeter
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