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1. Einleitung

1.1 Bindegewebe

Das Binde- und Stützgewebe kommt ubiquitär im Organismus vor und wird aus Kollagenen und elastischen Fasern sowie aus Proteoglykanen aufgebaut. Bindegewebe, wie zum Beispiel Knorpel, Knochen, Sehnen, die Cornea und der Glaskörper des Auges entstehen ursprünglich aus dem Mesoderm im Laufe der Embryogenese.
Diese Binde- und Stützgewebe bestehen aus geweblichen Funktionseinheiten, die man im Knochen als Osteone und im Knorpelgewebe als Chondrone bezeichnet.
Diese sind reich an Interzellulärsubstanz, die auch als extrazelluläre Matrix gennant wird und eine wichtige Rolle bei der Aggregation, Organisation und und Spezialisierung der Zellen spielt. Wird eine solche gewebliche Funktionseinheit zerstört, so zieht diese zunächst die Umgebung, später auch den gesamten Gewebeverband in Mitleidenschaft.
Auf Grund dieses pathogenetisehen Prinzips erklärt sich auch die Tatsache, daß die Binde- und Stützgewebe auf Zellschädigungen mit verwandten Reaktionsmustern antworten.

1.2 Knorpel (Arten von Knorpel)

1.2.1.1 Der Faserknorpel

Der Faserknorpel kommt in den Zwischenwirbelscheiben, der Schambeinfuge und in den Menisken vor.
Der Zellanteil ist sehr niedrig. Auffällig sind die großen dichtgepackten Kollagenfasern in der extrazellulären Matrix.
Die Hauptfunktion dieses widerstandsfähigsten Knorpeltyps besteht in der Lastübertragung und Stoßdämpfung zwischen knöchernen
Skeletteilen.

1.2.1.2 Der elastische Knorpel

Den elastischen Knorpel findet man im äußeren Gehörgang, dem äußere Ohr und einigen Kehlkopfknorpeln. Er ist charakterisiert durch große elastische Fasern, deren Komponente Elastin diesem Knorpeltyp ein gelbliches Aussehen verleiht.
Der elastische Knoipel verknöchert normalerweise nicht und ist nicht regenerierbar.
1.2.1.3 Der hyaline Knorpel
Der hyaline Knorpel ist mengenmäßig am bedeutendsten. Er bildet das embryonale Skelett, den sternalen und dorsalen Teil der Rippen, das Nasenseptum, Teile des Kehlkopfes, die Knorpelspange der Luftröhre und der großen Bronchialäste sowie die Gelenkoberflächen.
Er zeigt ein milchig glasiges Aussehen. Seine Matrix enthält Fasern, die aber weder makroskopisch noch nach geeigneter Anfärbung in lichtmikroskopischer Histologie zu erkennen sind. Elektronenmikroskopisch sind jedoch typische gebänderte Fibrillen zu erkennen, die sich je nach Vorkommen in teritorialen Matrixzonen in der Nähe und in interterritorialen Zonen weiter von den Zellen entfernt, in ihrer Dicke und Ausprägung des Bandenmusters unterscheiden. Schwerpunkt dieser Arbeit ist hyaliner Knorpel.

1.2.2 Knorpelentwicklung

1.2.2.1 Embryonale Skelettentwicklung

Drei embryonale Zellstrukturen bilden das frühe Skelett. Die Neuralleiste, eine Gewebestruktur ektodermalen Ursprungs, bildet den Branchialknorpel und den Schädelknochen.
Die anderen Skelettstrukturen entwickeln sich aus mesodermalen Geweben. Die aus den Ursegmenten (Somiten) hervorgehenden Anlagen der Wirbelsäule, die sogenannten Sklerotome, entwickeln das axiale Skelett. Das Extremitätenskelett entsteht aus den chondrogenen Vorläufern des lateralen Plattenmesodenn (Oasen et al., 1996).
Die Herausbildung der Gliedmaßenknospen beim Hühnerembryo ist ein sehr gut studiertes System der Chondrogenese und Entwicklung des Extremitätenskeletts. Von Hamburger und Hamilton (1951) wurde die 21-tägige Entwicklung des Hühnembryos im Ei nach morphologischen Kriterien beschrieben und in 46 Entwicklungsstufen unterteilt.
Die Gliedmaßenknospen bilden sich nach etwa 51- stündiger Embryonalentwicklung beziehungsweise auf der 15. Entwicklungsstufe nach Hamburger und Hamilton (HH15).
Durch das Zusammenwirken der Zone der polarisierenden Aktivität, des apikalen ektodermalen Grats und des dorsalen Ektoderms wird das Entwicklungsmuster in der frühen Gliedmaßenknospe gesteuert (Tickle und Eichele, 1994). Transplantationsstudien haben gezeigt, daß die Information über die anatomische Entwicklung der einzelnen Strukturen schon in den Gliedermassen der sehr frühen Entwicklungsstadium selbst enthalten ist (Koyama et al., 1996; Harison et al., 1918).
Hierbei spielen die Transkriptionsfaktorcn der Homöoboxgene für die Polarität des entwickelnden Gewebes eine zentrale Rolle (Tabin 1991). Außerdem haben lösliche Signal-Faktoren wie die TGF-ß- und FGF-Familie, Bedeutung für die komplexe Regulation dieser Gliedmaßenentwicklung. Der erste Schritt der skelettalen Morphogenese ist die Induktion des undifferenzierten Mesenchyms und die Bildung des kondensierten Mesenchyms, das schließlich zu den knorpeligen Skelettanlagen differenziert.

1.2.2.2 Chondrogenese

Die Gliedmaßenknospe besteht aus mesenchymalen Zellen, die mit Ektoderm bedeckt sind.
Die mesenchymalen Zellen produzieren Kollagen I und Kollagen III, Fibronectin, und kleine Mengen von Proteoglykanen. Die Chondrogenese beginnt, wenn prächondrogene mesenchymale Zellen anfangen, sich dicht zusammen zu lagern. Zu diesem Zeitpunkt beginnen die Zellen Aggrecan und Kollagen II anstelle von Kollagen I und Kollagen III zu produzieren (Von der Mark, 1980; Ede und Shamslahidjane,1983).
Kurz danach produzieren die Chondrozyten während der Chondrogenese Kollagen XI und Kollagen IX, Proteoglykane, Linkprotein und einige nicht-Kollagene Matrixproteine. Die Differenzierungssignale, die für die Knorpelbildung verantwortlich sind, können zum einen durch entwicklungsbiologische Untersuchungen und zum anderen mit Zellkulturstudien näher aufgeklärt werden.
Die Untersuchung induktiver Signale für die Chondrogenese setzt voraus, daß man pluripotente mesenchymale Zellen (die kondensierenden mesenchymalen Zellen, die für verschiedenen Entwicklungswege, z.B. Fett, Muskel und Knorpel entscheiden können) untersuchen kann, deren Entwicklungsweg noch nicht festgelegt ist.

1.2.2.3 Mesenchymale Stammzellen und Zellinien

Verschiedene Zellkultursysteme sind zur Kultivierung von mesenchymalen Vorläuferzellen etabliert worden. Bei Untersuchungen mit mesenchymalen Vorläuferzellen hat man festgestellt, daß diese pluripotent, d.h. myogen, osteogen, chondrogen und adipogen sind.
Diese Hypothese hat man experimentell mit embryonalem Gewebe, zum Beispiel Gewebe der Gliedmaßenknospen (Koniecny und Emerson, 1984; Grigoriadis et al. 1988) im Knochenmark (Berry 1992) und im Periostium (Nakase 1993) bestätigt. Die mesenchymalen Vorläuferzellen können bei der embryonalen Zellinie C3H10T 2 aus Mäusen (Taylor and Jones, 1979), der multipotenten mesenchymalen Zellinie RCJ 31 (Grigoriadis et al., 1989), sowie bei der skelettalen Zellinie CFK2 (Bernier und Goltzman, 1993) zu Knorpelzellen differenzieren. Außerdem ist die Isolierung von chondrogenen Zellinien aus Teratokarzinomen (Darmon et al.,1984, Atsumi et al., 1990) und aus Chondrosarkomen (Mukhopadhyay et al., 1995) beschrieben. Weiterhin gibt es noch die immortalisierte Zellinie, wie wT 2- Klone (Wang et al., 1993 ) und die aus Teratokarzinomen stammende Zellinie Cl.
Bei dieser Zellinie können durch Zugabe von 10-6 M Dexametason 80% die Zellen in Kultur zu Chondroblasten-ähnlichen Zellen differenzieren, während die Zellen unter der Wirkung anderer Signale zu Adipozyten oder Osteocyten differenzieren. Die nicht induzierten Zellen verkörpern offenbar eine stabile mesenchymale Vorläuferzellinie, die ihre Multipotenz bewahrt (Poliard et al., 1995).

1.2.2.4 Regulation der Chondrogenese

Zell-Zell-Kontakte, Zell-Matrix-Wechselwirkungen und diffundierende Faktoren spielen eine regulierende Rolle bei der Chondrogenese. Bei der Chondrogenese liegen die Zellen in Gruppen vor (Ahrens et al., 1977). Während der Zellkondensation zeigten Mackie et al., 1987 eine Expression von Tenascin und dessen Beteiligung an der Chondrogenese. Für verschiedene Matrixmoleküle wurde eine transiente Expression beobachtet, was auf eine mögliche funktionelle Bedeutung dieser Moleküle hinweist. Dazu zählen Fibronectin (Tomasek et al., 1982; Kulyk et al., 1989) und Versican (Kiinata et al., 1986), die im Verlauf der Chondrogenese stark exprimiert sind. Die Wechselwirkungen spezieller Zelloberflächenmoleküle vermitteln die Zell-Zell-Kontakte. Anti-Syndecan-3-Antikörper können in Zellkulturen die Kondensation der Knorpelvorläuferzellen wirksam unterdrükken (Seghatoleslami und Kosher. 1996). Die Expression der Zelladhäsionsmoleküle NCAM (neural cell adhäsion molecule) und der Ca2+-abhängigen N-Cadherine beeinflussen die Kondensation der Vorläuferzellen (Tavella et al., 1994, Widelitz et al., 1993). Durch Applikation von Antikörpern, die spezifisch mit dem N-Cadherin reagierten, konnte in der Kultur die Chondrogenese unterdrückt werden (Oberlender und Tuan, 1994). Zanetti und Solursh, (1984) stellten bei Untersuchungen an Zellkulturen aus Gliedmaßenknospen des Huhns fest, daß die Änderung der Zellmorphologie durch experimentelle Manipulation des Zytoskeletts eine weitere Voraussetzung für die Knorpeldifferenzierung darstellt.
Durch Störung des Aktinzytoskelettbildung mit Cytochalasin rundeten sich die Zellen ab. Statt einer langgestreckten, abgeflachten und einer für adhärierende Zellen typischen Morphologie weisen die Zellen mit Knorpeleigenschaften eine abgerundete Gestalt auf. Daß diffundierende Signale ebenfalls eine wichtige Rolle spielen, konnte besonders für Vertreter der TGF-ß Familie wie Aktivin ( Jiang et al., 1993) und bone morphogenetic protein 2 und 4 (BMP ) (Chen et al., 1991) in Experimenten an Gliedmaßenknospenzellen in Kultur gezeigt werden.

1.2.2.5 Differenzierung von norpelzellen

Im heranwachsenden Organismus wird das Knochenbildung und Knochen längen Wachstum durch einen Differenzierungsprozeß der Chondrozyten in der epiphysären Wachstumsfuge erreicht, der als Knorpelspätdifferenzierung bezeichnet wird (Poole, 1991).
Chondrozyten zeigen auf charakteristische Weise in vitro und in vivo für weitere Differenzierung eine phenotypische Flexibilität. Die Differenzierung verläuft von mesenchymalen Vorläuferzellen, über Ruhe- und proliferienden Chondrozyten bis hin zu schließlich hypertrophen Chondrozyten. Die Knochengewebe ersetzen den größten Teil des Knorpelgewebes durch endochondrale Ossifikation. Nur ein gringer Teil bleibt als Gelenkknorpel an den Enden der Röhrenknochen erhalten. Unter physiologischen Bedingungen verharren diese Knorpelzellen in einem niedrigen Enddifferenzierungszustand.
Lediglich bei pathologischen Veränderungen kommt es zur Weiterdifferenzierung.
Beispielsweise lassen sich bei degenerativen Knorpelerkrankungen in Nachbarschaft zum geschädigten Gelenkknorpel proliferative und hypertrophe Chondrozyten nachweisen (von der Mark, 1992).

1.2.3 Die Wachstumsfuge

Die Wachstumfuge ist eine spezielle Form von hyalinem Knorpel, die für das skelettale Längenwachstum verantwortlich ist.
Sie ist eine kleine scheibenförmige Verbindung Stelle zwischen Epiphyse und dem Ende der Diaphyse von Röhrenknochen.
Diese epiphysäre Wachstumfuge wird in verschiedene Zonen unterteilt (Hunziker et al., 1987).

In der Ruhezone befinden sich die Ruhechondrozyten, die eine abgeflachte Form haben und kaum metabolisch aktiv sind. Die Ruhechondrozyten sind klein und liegen einzeln oder paarweise vor.
In der proliferativen Zone teilen sich die Knorpelzellen, werden größer und ordnen sich dabei säulenartig in der Längsachse des Knochens an. Dieses wird als klonale Expansion in Richtung Diaphyse bezeichnet. Die Chondrozyten in dieser Zone synthetisieren überwiegend die im Knorpel vorkommenden Kollagene II, IX und XI, sowie das Knorpelproteoglykan Aggrecan. Die Chondrozyten in der unteren Proliferationszone weisen mehr endoplasmatisches Retikulum, einen größeren Golgi-Apparat und mehr sekretorische Vesikel auf. In der Matrix der Proliferationszone kommen Matrixvesikel (100-200nmÆ) vor, deren Funktion noch unvollständig verstanden ist. Sie befinden sich in diesem Falle in nicht-mineralisierter Knorpelmatrix. In der hypertrophen Zone stellen die Chondrozyten ihre Proliferation ein und steigern ihre metabolische Aktivität, so daß die Zellen mehr Matrix produzieren, größer werden und mehr auseinander driften. In dieser Zone produzieren die Chondrozyten Kollagen X, das charakteristisch für hypertrophe Chondrozyten ist. Im weiteren Verlauf wird die Zellmatrix der hypertrophen Chondrozyten
kalzifiziert. Die Mineralisierung beschränkt sich auf eine schmale Schicht hypertropher Chondrozyten in direkter Nachbarschaft zum subchondralen Knochen. Auch hypertrophe Chondrozyten produzieren Matrixvesikel. Diese Variante von Matrixvesikcln enthalten Annexin V, alkalische Phosphatase, Aktin und eine große Menge Calcium (Kirsch und Wuthier, 1994) und sind die Ausgangspunkte für die Mineralisierung. Die endothelialen und osteoblastischen Zellen wandern aus dem subchondralen Knochen in die zurückgelassene Matrix ein. Der Knorpel wird schließlich bis zum Ende der Reifung des Organismus vollständig durch Knochen ersetzt. Untersuchungen von Hunziker et al., (1987) an Wachstumsfugen von Ratten haben gezeigt, daß ein Chondrozyt diesen Weg von der Ruhezellen- über die proliferative Phase bis zum hypertrophen Stadium in 3-4 Tagen durchläuft. Das Längenwachstum der Röhrenknochen findet hauptsächlich durch Zeltlung der Chondrozyten in der Proliferationszone, aber auch durch Volumenzunahme und die
Matrixproduktion der Chondrozyten in der Proliferations- bzw. Hypertrophiezone statt.
Bei einem Knochenbruch sind undifferenzierte Mesenchymalzellen aus dem Perichondrium in der Lage, den Spalt zwischen den Knochenfragmenten zunächst mit Knorpel zu füllen. Der
entstehende Knorpelkallus legt sich als spindelförmige Verdik-kung um den Bruch und füllt die Lücke zwischen den beiden Knochen fragmenten aus. Die Resorption des Knorpelkallus und dessen Ersatz durch Knochengcwebe erfolgt durch den Prozeß der endochondralen Ossifikation.

1.2.4 Struktur und Funktion von Gelenkknorpel

Der Gelenkknorpel ermöglicht durch seine elastischen und stoßdämpfenden Eigenschaften eine reibungsarme Übertragung der durch das Skelett ausgeübten Kräfte und erleichtert die
Artikulation. Der ausdifferenzierte, adulte Gelenkknorpel hat keine Blutgefäße und Nerven.
Die Versorgung der Zellen findet durch Diffusion der Nährstoffe aus der Synovialflüssigkeit des Gelenkes und dem subchondralen Knochen statt. Der Gelenkknorpel liegt von der Oberfläche bis zum Knochen in drei nicht-mineralisierten Zonen vor:

a) die Tangentialzone
b) die Übergangszone
c) die Radialzone und eine mineralisierte Zone (Abb.

1.4). Am oberen Teil der Tangentialzone befinden sich keine Chondrozyten.
Die Chondrozyten im unteren Teil der Tangentialzone sind spindelförmig, flach und ellipsoid.
Die Chondrozyten in der Radialzone sind eiförmig und größer. Die Stammzellen in der Tangentialzone diffundieren in die Übergangszone.
Im oberen Breich der Radialzone proliferieren die Chondrozyten. Durch weitere Differenzierung in der mittleren und unteren Radialzone erfahren die Zellen eine Größenzunahme und bilden die erwähnten Säulenstrukturen aus. An die Radialzone schließt sich zum subchondralen Knochen hin eine mineralisierte Zone an.
Diese ist scharf begrenzt. Ihr oberes Rand wird deshalb als Tidemark bezeichnet. Sowohl Proliferation als auch die Säulenbildung sind aber im Gelenkknorpel deutlich weniger ausgeprägt, als in der Wachstumsfuge.

1.2.5 Weiterdifferenzierung

Es gibt Tür die Weiterdifferenzierung eines hypertrophen Chondrozyten zahlreiche Hinweise von einer direkten Transdifferenzierung von Chondrozyten zu Osteoblasten. Lian et al., (1993) und Strauss et al., (1992) fanden die Knochenproteine Osteocalcin und Osteopontin in Zellkulturen von späthypertrophen Chondrozyten. Ebenfalls konnte gezeigt werden, daß epiphyseale Hühnerchondrozyten, die bereits in vitro hypertroph waren, nach Transfer zu adhärenten Kulturbedingungen zu Osteoblasten-ähnlichen Zellen weiterdifferenzierten (Descalzi Cancedda et al., 1992, Gentili et al., 1993). Am Ende der Spätdifferenzierung teilen sich hypertrophe Chondrozyten noch einmal. Sinn dieser
Zellteilung ist, den Tochterzellen die Gelegenheit zur weiteren Differenzierung in Osteoblasten zu verleihen. Die Zellzahlverdoppelung als solche ist zu diesem Zeitpunkt jedoch nicht mehr benötigt. Aus diesem Grunde schalten die nicht weiter notwendigen Zellen das Programm des aktiven Zelltodes (Apoptose) ein (Roach et al., 1995). Außerdem gibt es
noch Hypothese, die erst einen apoptotischen Zelltod vorschlägt, nach welchem die Osteoblasten, die entweder aus dem Perichondriiim oder aus Gefäßen stammen, die Chondrozyten dannach ersetzen.

1.2.6 Knochenbildung

Die Chondrozyten werden hypertrophiert und synthesieren Kollagen X und alk. Phosphatase.
Im interzellulären Raum fängt es an zu mineralisieren , wodurch die Permeation der Nährstoffe praktisch unterbrochen wird, sodaß die Chondrozyten zugrunde gehen.
Das hyalinknorpelige Primordialskelett wird langsam bis auf wenige knorpelig bleibende Abschnitte ( Gelenkknorpel, Rippenknorpel, usw.) durch Knochen ersetzt. Diese Art von Knochen, die das Knorpelmaterial nach seiner Degeneration ersetzen, nennt man Ersatzknochen (indirekte Ossifikation). Die Knochen, die direkt von mesenchymalen Vorläuferzellen abstammen, bezeichnet man als Bindegewebsknochen (direkte Ossifikation). Die Osteoblasten stammen aus osteogenetischen Stammzellen, die ihrerseits aus Mesenchymzellen hervorgehen. Die Osteoblasten sezernieren Osteoide.

1.2.6.1 Desmale Ossifikation

Die Mesenchymzellen vermehren sich an bestimmten Stellen reichlich und differenzieren zu osteogenetischen Stammzellen und Osteoblasten. Es treten Kollagenfibrillen auf, die sich bündeln und durch flechten; ferner kommt es zu einer stockenden Vaskularisierung. Mit der Bindung der Grundsubstanz entsteht dann ein Osteoid.
Aus Osteoiden entsteht durch Verkalkung Knochen. Dieser so genannte Geflechtknochcn wird schon beim Kind durch Lamellenknochen ersetzt. Das zell- und gefäßreiche primäre Knochenmark liegt zwischen Knochenbälkchen, die Oseozyten enthalten. An der Oberfläche von Knochenbälkchen sind Anbau- und Abbauvorgänge der Osteoide zu erkennen.

1.2.6.2 Chondrale Ossifikation

Unter chondraler Ossifikation versteht man perichondrale und enchondrale Ossifikationen.
Enchondrale Ossifikation läuft grundsätzlich wie desmale Ossifikation. Bei der endchondralen Knochenbildung kommt es zuerst zur Ablagerung von Ersatzknochen (indirekte Ossifikation).
Nun dringt am Ort der späteren Foramina nutrica vor der Cambrium-Schicht gefäß- und zahlreiches junges Bindegewebe durch die Knochenmanschette hindurch in den verkalkten Knorpel ein. Dabei wird die Knorpelzwischensubstanz durch Chondrozyten, die mit den später zu besprechenden Osteoklasten identisch sind, aufgelöst.Dadurch entsteht ein großer Hohlraum,
die sogenannte primäre Markhöhle, die nachher das primäre Knochenmark enthält. Das primäre Knochenmark enthält sowohl Osteoblasten als auch Osteoklasten.

1.3 Die extrazelluläre Matrix

Die funktionellen Eigenschaften des hyalinen Knorpels sind abhängig von der molekularen Struktur jedes seiner Bestandteile, ihrer Konzentration im Gewebe, und ihren Wechselwirkungen.
Die große Bedeutung der extrazellulären Matrix im Bindegewebe erfordert eine genauere Beschreibung der beteiligten Moleküle.
Den Hauptbestanteil der Matrix bilden Kollagene und Proteoglykane.
Die bis heute bekannten 22 Kollagentypen stellen eine heterologe Gruppe verwandter Proteine dar. Sie sind ein wichtige Bestandteil der Fibrillen in extrazellulären Matrix.
Proteoglykane setzen sich aus Polysaccharid- und Proteineinheiten zusammen. Durch die hohe negative Ladung der Polysacharidseitenketten beeinflussen Proteoglykane maß geblich die viskoelastischen Eigenschaften der extrazellulären Matrix. Neben Kollagenen und Proteoglykanen kommen weitere Proteine, wie die großmolekularen Glykoproteine Fibronektin, Laminin, Tenascin sowie Elastin vor. Fibronektin, ein nicht-kollagenartiges Protein, ist in der Lage, Mikrofasern zu bilden. Durch die Fähigkeit, sowohl an Zellen wie auch an Matrixproteine binden zu können, ermöglicht Fibronektin den Zellen die Wechselwirkung mit der extrazellulären Matrix. Tenascin bildet einen sechsarmiges, sternförmiges Oligomer in der extrazellulären Matrix. Es handelt sich um ein Protein, das Zellmatrixwechselwirkungen beeinflußt. Es vermittelt sowohl Zelladhäsion als auch Zellabstoßung und kann an Proteoglykane und Fibronektin binden. Die Expression von Tenascin ist eng gekoppelt an
morphogenetische Ereignisse, wie embryonale Zellwanderung, Wundheilung und Tumorbildung.

1.3.1 Kollagen

Der Begriff Kollagen leitet sich aus dem Griechischen ab (kolla – Leim, und genoV- Geburt). Rund ein Viertel des Gesamtproteingewichtes bei Säugetieren bilden die Kollagene. Sie kommen bei allen mehrzelligen Organismen vor und bilden die wichtigsten faserigen Bestandteile der Haut, der Knochen, der Sehnen, der Blutgefäße, der Zähne und des Knorpels. Was Kollagene von anderen Proteinen unterscheidet, ist die tripelhelikale Struktur. Kollagenmoleküle bestehen aus drei mit der Aminosäuresequenz (Gly-X-Y)n zusammen rechtshändig verdrillten Polypeptidketten, sogennanten a-Ketten (Rieh und Crick, 1961). Jede a-Kette entspricht in ihrer Struktur einer linkshändigen Polyprolinhelix, die durch den hohen Anteil an Aminosäuren stabilisiert ist (Segal et al., 1969 ).
Prolin besetzt häufig die X-Position und Hydroxyprolin findet sich oft in der Y-Position.
Kollagene bestehen entweder aus drei gleichen Polypeptidketten (Homotrimer) oder aus zwei oder drei unterschiedlichen Polypeptidketten (Heterotrimer). Das Auftreten eines Glycinrestes an jeder dritten Position ist für die helixförmige Struktur der Kollagene unabdingbar, weil keine anderer Aminosäureseitenkette als ein Wasserstoffatom im dicht gepackten Zentrum der Tripelhelix ausreichend Platz findet.
Die Kollagenmleküle bilden, zum Teil mit anderen Kollagentypen oder Molekülen, supramolekulare Aggregate in der extrazellulären Matrix. Eine besondere Eigenschaft ist die Bildung fibrillärer Strukturen. Basierend auf diesen Polymeren Strukturen werden die Kollagentypen in verschiedene Klassen eingeteilt. Es ist allerdings eher der Fall, daß bestimmte Kollagentypen einzigartige Suprastrukturen mit spezieller Aufgabe bilden und somit eine Klasse für sich darstellen. Außerdem hat sich gezeigt, daß Fibrillen des Bindegewebes eine komplexe Struktur aufweisen und aus unterschiedlichen Komponenten zusammengesetzt sind, die nicht isoliert betrachtet werden können (Review, Prockop and Kivirikko 1995).
Die wichtigen fibrillenbildenden Kollagene sind die Kollagene I, II, III, V und XI, die eine Länge von ungefähr 300 nm und im zentralen Teil eine große tripelhelikale Domäne mit etwa 1000 Aminosäuren in jeder Kette aufweisen (van der Rest und Garrone, 1991). Die fibrillenbildenden Kollagene werden als Prokollagene sezerniert und bestehen zu diesem Zeitpunkt aus einer großen tripelhelikalen Domäne (mit 1009 bis 1029 Aminosäure resten in jeder Kette), die über kurze Telopeptide (15-26 Aminosäurereste) mit N- und CPropeptiden verbunden sind (Kühn, 1987). Die C-Propeptide (244-246 Aminosäuren) der fibrillenbildendcn Kollagene sind stark homolog und erhalten Informationen für die Initiation der Tripelhelixfaltung (Doege und Fessler, 1986). Die N-Propeptide haben eine kurze tripelhelikale Domäne (41-105 Aminosäuren), der sich eine nicht tripelhelikale Nterminale Domäne von variabler Größe und Struktur anschließt (7-407 Reste). Nach Abspaltung der Propeptide im Extrazellulärraum durch spezifische Endoproteinasen können sich die Kollagenmoleküle aneinanderlagern und Fibrillen bilden. Es gibt außerdem FACIT-Kollagene (fibril associated collagens with interrupted triple helices), die unterbrochene Teripelhelixes aufweisen und zu denen die Kollagentypen IX, XII, XIV, XVI und XIX zählen (Shaw und Olsen, 1991). Bisher hat man die Kollagenmoleküle II, VI, IX, X, XI, XIV und XVI, von denen die Kollagene II, IX, X und XI besonders wichtig sind, im Knorpel gefunden.
Kollagen X und VIII enthalten eine kurze tripelhelikale Domäne (140 nm).

1.3.1.1 Die Biosynthese und Sekretion von Prokollagen

Die Synthese der Kollagene (Abb.l.6A) soll am Beispiel des am besten untersuchten fibrillenbildenden Kollagens I gezeigt werden. Kollagen II und III scheinen auf ähnliche Weise prozessiert zu werden. Die einzelnen Polypeptidketten werden als große Vorläufermoleküle, pro-a-Ketten, an den Ribosomen des rauhen endoplasmatischen Retikulum synthetisiert und in das Lumen des endoplasmatischen Retikulum sezerniert. Während der Translation werden Prolin- und Lysinreste durch Enzyme, Prolyl- bzw Lysyloxidase, hydroxyliert. Hydroxylysin kann durch Glykosylierung weiter modifiziert werden.
Nach abgeschlossener Translation der Polypeptidketten vom Ribosom kommt es zur Bildung von Disulfidbrücken zwischen den C-terminalen Enden der Peptidkettcn. Die aggregierten CPropeptide funktionieren als Keim der Tripelhelixfaltung, die in Richtung des aminoterminalen Endes fortschreitet. Nach beendeter Faltung der Tripelhelix finden keine weitere Hydroxylierungs- und Glykosierungsmodifikationen an den einzelnen Ketten mehr statt.

1.3.1.2 Prozessierung von Prokollagenen im extrazellulären Raum

Die Strukturen von Prokollagenen und ihren Prozessierungs-Zwischenprodukten (pNKollagen, pC-Kollagen und Kollagen) werden in Abb.l.7A,D gezeigt. Aufnahmen von isolierten Prokollagenmolekülen und pN-Kollagenen der Fibrille konnten zeigen, daß sich das pN-Propeptid über dem tripelhelikalen Bereich zurück faltet (Abb.l,7B). Der biologische Grund für das Zurückfalten des Prokollagens ist noch nicht geklärt.
Man vermutet, daß dieses Phänomen an der Prozessierung des pN-Kollagens und der Regulation der Kollagenfibrillenmorphologie beteiligt sein könnte. Sequenzanalysen zeigen die Stabilität der pN-Kollagenkonformation durch intramolekulare (hydrophobe und hydrophile) Wechselwirkungen (R.B.Watson 1993).
Die Prokollagen-Proteasen sind im wesentlichen verantwortlich für die Umsetzung von Prokollagen zu Kollagen, das sich im extrazellulären Raum zu Fibrillen assoziiert.
Die Prokollagen N-Protease schneidet das N-Propeptid von Prokollagen I, II und III an der spezifischen Stelle des Substrates. Die Prokollagen-N-Protease katalysiert die Umsetzung vom Prokollagen zum pC-Kollagen und vom pN-Kollagen zum Kollagen. Die Prokollagen- C-Peptidase katalysiert die Umsetzung vom Prokollagen zum pN-Kollagen und vom pCKollagen zum Kollagen.

1.3.1.3 Die Haupt-Kollagentypen des Knorpels

i) Kollagen II
Kollagen II ist ein homotrimeres Molekül, das sich aus drei a1 -Ketten zusammensetzt [a1(II)]3, von denen jede 1050 Aminosäuren enthält. Mit einem Anteil von mindestens 80%
ist Kollagen Typ II die häufigste Kollagenspezies im Knorpel (Miller und Matukas., 1969).
Die a1(II)-Kette hat eine große Sequenzhomologie zur a1(I)-Kette (Petit et al., 1992, Stark et al. 1972). Die a 1(II)-Kette zeigt aufgrund ihres höheren Gehaltes an Hydroxylysin eine stärkere Glykosierung (Miller, 1976). Kollagen II kommt außer im Knorpel auch noch im Glaskörper und während der Embryonalentwicklung in verschiedenen anderen Geweben
vor. Das COL2Al-Gen entspricht Prokollagen II und ist durch 50 Exone kodiert, von denen über 40 Exone zur tripelhelikalen Domäne gehören.
Exon 2 kodiert eine Cystein-reiche Domäne aus 69 Aminosäuren, die dem N-terminalen Propeptid in der Pro a1(l), der Proa1(III) und der Pro a2( V)-Kette entspricht. Das Kollagen IIA hat diese Domäne, während sie in der Kollagen IIB-Form fehlt. Prokollagen IIA findet sich bei der Embryonalentwicklung in den Knorpelvorläuferzellen, die fibroblastenähnlich aussehen (Sandeil et al., 1991; Nah und Upholt 1991). Diese Umwandlung von Kollagen II könnte eine Rolle bei der Embryonalentwicklung spielen. Außerdem wird vermutet, daß das Nterminale Propeptid des Kollagen II eine Feedback-Hemmung auf die Kollagensynthese ausübt (Fouser et al., 1991)

ii) Kollagen IX
Im Gegensatz zu Kollagen II bildet Kollagen IX ein Heterotrimer der Zusammensetzung a1(IX), a1(IX), a3(IX). Es ist der Prototyp der FACIT- Kollagengruppe und setzt sich aus drei tripelhelikalen Domänen und vier nicht-tripelhelikalen Domänen, die als COLDomänen, bzw. NC-Domänen bezeichnet werden, zusammen. Durch Pepsinbehandlung werden die NC-Domänen verdaut, so daß Kollagen IX in zwei Untereinheiten, LMW (low molecular weight) und HMW (high molecular weight) zerfällt. Die Polypeptid ketten der Untereinheiten verbinden sich durch Disulfidbrücken. Außer der NC4-Domäne der a1- Kette mit 243 Aminosäuren sind die anderen NC-Domänen sehr kurz (12-23 Aminosäuren).
Die NC3 Domäne der a2(IX) Kette weist 5 zusätzliche Aminosäuren auf, die eine Bindungsstelle für eine Glykosaminoglykankette enthalten. Während die COL3 Domäne von den Fibrillenoberfläche herausragt, sind COL1 und COL2 in den Fibrillenkörper
integriert. Die NC4-Domäne fehlt im Notochord (Hayashi et al. 1992), dem Glaskörper (Yada et al., 1990) und der Cornea (Svoboda et al. 1988), weil in diesen Organen ein
alternativer Promotor des al(IX)-Gens verwendet wird (Svoboda et al., 1988 und Nishimura et al., 1989). Die Lysinreste in der COL2-Domänc gehen eine kovalente Quervernetzung mit dem N-Telopeptid des Kollagens II ein. (Apone et al., 1988;Von der Rest und Mayne, 1988).
Kollagen IX-Moleküle weisen ausserdem untereinander Quervernetzung auf (Wu et al., 1992). Die anionische NC4-Domäne und Glykosaminoglykane sind in der Lage, Wechselwirkungen mit anderen Matrixmolekülen einzugehen. Deswegen ist denkbar, daß
Kollagen IX die Wechselwirkung zwischen Fibrillen und anderen Matrixmolekülen vermittelt. Kollagen IX bindet an die Oberfläche der Fibrillen. Deswegen wird vermutet,
daß Kollagen IX die Fibrillenabstände von Knorpelfibrillen reguliert. Kollagen IX wird als reifes Molekül sezerniert und unterliegt keiner weiteren Prozessierung im extrazellulären Raum.

iii) Kollagen X
Kollagen X weist keine oder nur eine geringfügige extrazelluläre Prozessierung auf und liegt als Homotrimer al(X) vor. Das Molekulargewicht der al-Kette von 59 kDa wird durch
limitierte Pepsin-Behandlung auf 48 kDa reduziert.
Kollagen X dient als ein Indikator für das späte Stadium der Chondrozytendifferenzierung.
Als erste haben Schmid und Conrad 1982 festgestellt, daß sich Kollagen X beim Vogel nur in hypertrophen Knorpel-Bereichen findet. Die weiteren Untersuchungen haben diese Hypothese bestätigt (Oshima et al., 1989; Liama et al., 1991; Linsenmayer et al., 1991; Kirsch und Von der Mark, 1991).
Einzige Ausnahme ist die Existenz von Kollagen X in der Eierschale. Bei der Rachitis nimmt die Kalzifizierung der Wachstumsfuge ab und die hypertrophe Zone wird breiter. Deswegen erwartet man mehr Kollagen X.
Aber Forschungsergebnisse weisen darauf hin, daß sich die Produktion von Kollagen X reduziert, weil die Konzentration von Serumkalzium abnimmt. In artikularem Knorpel findet sich
normalerweise kein Kollagen X. Von der Mark et al.1992 haben allerdings festgestellt, daß Kollagen X bei Osteoarthritis des Gelenkknorpels in oberen und mittleren Zonen von artikularem Knorpel zu finden ist.

A) Kollagen X Struktur
Das Kollagen X-Molekül besteht aus drei Domänen: einer kleinen nichthelikalen NTerminalen Domäne, einer helikalen Domäne und einer langen nichthelikalen CTerminalen Domäne. Der helikale Bereich enthält 460 Aminosäuren beim Vogel und 463 Aminosäuren beim Rind und beim Menschen. Im helikalen Bereich gibt es einige Imperfektionen
der (Gly-X-Y)n-Sequenz. An drei Stellen kommt anstatt der Gly-X-Y eine Sequenz von Gly-X-Y-Z-A vor, wo ein proteolytischer Angriff ermöglicht wird. (Welgus et al., 1990 ). Andere Imperfektionen des helikalen Bereichs von Kollagen X sind das Auftreten von Gly-X-Gly. Diese Imperfektion kommt nicht im Kollagen X des Huhnes vor.
Hier wird jedoch an der Stelle 1994 und 1997 der Aminosäurereste Glycin durch Cystein ersetzt (Kirsch und Von der Mark 1990; Thomas et al., 1991). Disulfidbrücken zwischen
helikalen Bereichen von Rinderkollagen X haben Yamaguchi et al., (1989) nach einiger Zeit in Zellkulturen festgestellt. Dieses fand man weiterhin auch bei Hund und Schaf. Bei Menschen, Kaninchen und Mäusen haben Marriott et al .,1991; Thomas et al., 1991; Apte et
al., 1992 kein Cystein im helikalen Bereich gefunden. An zwei Stellen des menschlichen Proteins wird eine X-Position des Gly-X-Y Triplets durch Glycin ersetzt, was wiederum beim Rind und Huhn nicht zu finden ist. Die C-terminale Domäne des menschlichen Kollagen X enthält 161 Aminosäuren und ist zu 89% der des Rindes und zu 77.7% mit des Huhnes identisch.
Die C-terminale Domäne enthält 13 Tyrosinreste, ungepaarte Cysteinreste und vermutlich Oligosaccharide. Es wird vermutet, daß die N-terminale Domäne nicht durch Proteasen abgespalten wird (Schmid und Linsenmayer., 1989 ).
Die helikale Domäne ist 138nm lang und zerfällt nicht durch Pepsin- und Chymotrypsinbehandlungen bei Raumtemperatur. Pepsin und Chymotrypsin spalten aber die globulären Teile des Kollagen X.

B) Suprastrukturelle Assoziation von Kollagen X
Nach der Doppelmarkierung von Kollagen X in Gewebe und in Zellkultur hat man festgestellt, daß Kollagen X in zwei suprastrukturellen Formen vorliegt. In der Nähe von Zellmembranen (perizellulärer Raum) findet sich Kollagen X als feines Filament und im interterritorialen Raum in Heterofibrillen zusammen mit Kollagen II (Schmid und Linsenmayer, 1991; Chen et al., 1990). Diese letztere Organisationsform ist jedoch nicht unbestritten (Disseration Hagg, 1997). Kollagen X hat Potential, sich zusammen zu binden und ein hexagonales Netzwerk zu bilden. Rekonstitutionsexperimenten (Rotary Schadowing) und Markierung von Kollagen X-Aggregaten liefern einige Beweise, daß erstens C-terminal-globulare Domänen sehr wichtig für multimere Formen von Kollagen X sind und zweitens helikale Domänen sich parallel oder antiparallel assoziieren.Die Kollagen X-Moleküle aggregieren vermutlich am C-Terminus und bilden durch ihre nichtkovalenten Interaktionen eine hexogonale Struktur (Schmid et al., 1990). Die Aggregate scheinen sich durch Bildung von hexogonalen Strukturen zu stabilisieren (Kwan et al., 1991).
Dieses Potential von Kollagen X sich zu aggregieren, ist vermutlich das Grunde für die Entstehung des feinen Filaments von Kollagen X in perizellulärem Raum. Neu synthetisiertes Kollagen X aggregiert mit schon existierenden Fibrillen im hypertrophen Breich (Oshima et al., 1989; Linsenmayer et al., 1991).
Diese Assoziation ermöglicht eventuell die Beteiligung von Fibrillen bei der Kalzifizierung (Schmid et al., 1990), die Degradation der Fibrillen (Welgus et al., 1990) und die Interaktion der Fibrillen mit Proteoglykanen (Chen et al., 1992).
Um diese Assoziation von Kollagen X mit Fibrillen zu stabilisieren, geht Kollagen X eine kovalente Bindung mit Fibrillen ein (Chen et al., 1992).

C) Degradation von Kollagen X
Diese Imperfektion von Kollagen X wird durch Kollagenase an zwei Stellen gespalten.
So entsteht drei Fragmente, ein 32-kDa Fragment, ein 18-kDa tyrosinreiches C-terminales Fragment und ein 9-kDa N-terminales Fragment (Schmid et al., 1986), von denen 32-kDa-Fragment bei Körpertemperatur für längere Zeit stabil ist. Schmid et al. haben 1986 festgestellt, daß Kollagen X durch Kollagenase leichter als Kollagen II angegriffen wird.
Kollagen X wird durch verschiedene Proteasen wie Elastase (Gadher et al., 1988), die 72- kDa Gelatinase/Typ IV Kollagenase (MMP2) (Welgus et al., 1990), Stromelysin (MMP3) (J. Wu et al.,1991), die 92-kDa Gelatinase und die Metallproteinase (H. Welgus et al., 1993) abgebaut.
Ein Gemisch von Kollagenase und Interleukin l bewirkt die Degeradation des 32- kDa Fragmentes von Kollagen X (Gadher et al.,1990).
Kollagen X ist gegenüber verschiedenen Kollagenasen unterschiedlich empfindlich. Es wird von der Kollagenase des Uterus 500 mal schneller als von der Hautkollagenase gespalten. Ein Terminus des Kollagen X wird schneller als der andere gespalten (Welgus et al., 1990). Die leichtere Spaltung des Kollagens X, die Spaltung von Kollagen X durch verschiedene Protease und Anwesenheit von Kollagen X auf Heterofibrillen-Oberfläche weisen daraufhin, daß Kollagen X vielleicht eine Rolle bei der Degeradation der Matrix spielt.

D) Die Rolle des Kollagens X auf Kalzifizierung des Knorpels
Das Auftreten von Kollagen X vor der Mineralisation und nur in der hypertrophen Zone läßt vermuten, daß Kollagen X eine Rolle bei der Kalzifizierung spielt. Die experimentellen Ergebnisse führen jedoch zu kontroversen Schlüssen. Kollagen X befindet sich in der Mineralisationszone (Schmid et al., 1990; Gibson et al., 1990). Kirsch und Von der Mark haben 1991 die Bindung von Kalzium an Kollagen X mit Kd von 32 mM gezeigt. Kollagen X bindet an der Oberfläche von Matrixvesikeln (Habuchi et al., 1985). Wu et al. haben 1991 diese Hypothese bestätigt und darüber hinaus gefunden, daß die Bestandteile der Matrixvesikel Annexin VT, Annexin V (Annexin V kontrolliert die Calcium/Phosphat Transport im Matrixvesikel, Berendes et al.,1993) und alkalische Phosphatase an Kollagen
X gebunden werden. Die Zunahme der Kollagen X-Synthese in Zellkulturen während der Inkubation mit organischen Phosphaten (z.B. ß-Glycerophosphat) und Kalziumchlorid weist daraufhin, daß die Verstärkung der Kalzifizierung die Erhöhung der Kollagen XSynthese fördert (Thomas et al., 1990).
Andere Untersuchungen haben jedoch gezeigt, daß Kollagen X die Mineralisation verhindert.
Poole und Pidoux haben 1989 nach ultrastrukturellen Untersuchungen und Doppelmarkierung Kollagen X im perizellulären Bereich von Chondrozyten nachgewiesen. Sie fanden aber keine Mineralisation in diesem Bereich. Im inneren Bereich der Eierschale gibt es Kollagen X.
Dieser Bereich ist aber nicht kalzifiziert (Arias et al., 1991). Aufgrund unserer Untersuchungen gehen wir davon aus, daß Kollagen X nicht alleine sondern nur in der Zusammenspiel mit anderen Faktoren (z.B. alkalische Phosphatase) eine Rolle bei der Mineralisation haben konnte.

E) Einfluß von Faktoren und Hormonen auf die Kollagen X-Synthese
Gibson et al. haben 1982 festgestellt, daß der molekulare Zustand und die Art der Kultur einen Einfluß auf die Kollagen X-Synthese haben. Sie fanden weiterhin, daß ein Gemisch von Kollagen I und II in der Zellkultur die Kollagen X-Synthese stimuliert.
Auch Vitamin D, Vitamin C, ß-Glycerolphosphat und Calzium stimulieren die Kollagen X-Synthese (Oettinger and Pacifici 1990).

iv) Kollagen Typ XI
Kollagen XI wird der Gruppe der fibrillenbildenden Kollagene zugeordnet. Somit hat das Molekül eine große tripelhelikale Domäne ohne Unterbrechungen der GXY-Sequenz, die eine Länge von 300 nm hat. Das Protein kommt außer im Knorpel in vielen anderen Organen und Geweben vor (z B. Knochen, Glaskörper), besitzt dann jedoch eine andere Polypeptidzusammensetzung. Im Knorpel ist Kollagen XI ein Heterotrimer der Zusammensetzung al(XI), a2(XI) und a3(XI). Die a3(XI)-Kette leitet sich von demselben Gen ab, wie die al(II)-Kette, ist jedoch anderen posttranslationelen Modifikationen unterworfen (Die a3(XI)-Kette ist vermutlich eine stärker glykosylierte Form der a1(II)-Kette (Burgeson und Hollister, 1979) ). Die al(XI)- und die a2(XI)-Kette besitzen jeweils große Ähnlichkeit mit den entsprechenden Ketten des Kollagens V, was nicht nur zu häufigen
immunochemischer Kreuzreaktion der Kollagen V- und Kollagen XI-Ketten führt, sondernauch zu „hybriden” Kollagen V / Kollagen XI Heterotrimeren im Glaskörper [al(XI)]2 a2(V) oder im Knochen [al(XI)]2 a2(V) oder a1(XI) a1(V) a2(XI) (Wu und Eyre, 1991).
Die heterotypischen Kollagenmoleküle weisen unterschiedliche Stöchiometrien auf (Eyre and Wu., 1987; Niyibizi and Eyre 1989, Mayne et al., 1993).
Kollagen XI befindet sich im Innern der Fibrillen und könnte als Nukleationskern für die Fibrillenbildung dienen (Eikenberry et al., 1992).

1.3.1.4 Fibrillen und Fibrillenbildung

Unter allen Proteinkonformationen erlaubt die Kollagentripclhelix den höchsten Grad an Interaktionen zwischen zwei benachbarten Molekülen. Zwei Drittel aller Aminosäure- Resten liegen auf der Moleküloberfläche.
Die naheliegendste Interaktion ist somit die laterale Aggregation mit anderen Tripelhelices (van der Rest, 1990). Die Kollagentripelhelix besitzt aufgrund der Verteilung ihrer hydrophilen und hydrophoben Sequenzbereiche ein charakteristisches Ladungsmuster.
Elektrostatische Anziehung und hydrophobe Wechselwirkungen regulieren die Zusammenlagerung der Moleküle zu pentameren Mikrofibrillen. Wie Abbildung 1.9 schematisch zeigt, sind die 300 um langen Moleküle um ca. ¼ ihrer Länge gegeneinander verschoben. Diese axiale Anordnung wird als „quarter stagger model” bezeichnet. Sie ist die Ursache des typischen Bandenmusters, das man bei elektronenmikroskopischen Aufnahmen von Kollagenfibrillen nach Kontrastierung mit schweren Metallatomen beobachten kann. Das Bandenmuster zeigt eine Periode von 67 nm, die eine d-Bande und mehrere a-, b-, c- und e-Banden enthält. Eine dichter gepackte Zone (overlap zone) wechselt mit einer lockeren gepackten Zone (gap zone) ab (Kühn, 1987).

i) Das Modell der Knorpelfibrille
Die Fibrillen aus embryonalem Hühnerbrustbeinknorpel haben einen konstanten Durchmesser von 17 nm. Erst glaubte man, daß sie aus dem knorpelspezifischen Kollagen II aufgebaut sind und aufgrund ihrer versetzten Anordnung eine longitudinale Periodizität von 67 nm zeigen (Eikenberry et al., 1984). Kürzlich konnte jedoch gezeigt werden, daß isolierte und gereinigte Fibrillen nach Pepsin-Verdau die Kollagentypen II, IX und XI in einem molaren Verhältnis von 8:1:1 enthalten (Vaughan et al., 1988). Rotationsbedampfung der Fibrillen ergab eine d-periodische Verteilung von 35 – 40 nm langen Fortsätzen, die an ihren Enden eine globuläre Domäne tragen. Mit monoklonalen Antikörpern gegen Kollagen IX
konnten diese Fortsätze als Typ IX-Kollagen identifiziert werden (Vaughan et al., 1988).
Auch die beobachtete kovalente Quervernetzung von Kollagen II und IX (van der Rest, 1988) legt nahe, daß sie Komponenten der gleichen Fibrille sind. Demzufolge ist Kollagen IX auf der Fibrillenoberfläche d-periodisch angeordnet, wobei seine Chondroitinsulfatkette in die Gap-Region zu liegen kommt und die COL 3- und NC 4-Domänen aus der Fibrille herausragen (Abb. 1.10).

Bei der extrazellulären Prozessierung von Prokollagen I wird erst das N-terminale Propeptid von der spezifischen N-Proteinase bgespalten. Es entsteht ein sogeanntes pCKollagen I, ein Prokollagen, das noch das C-terminale Propeptid enthält. Beim Prokollagen III wird zuerst das C-terminale Propeptid abgespalten und es resultiert das pN-Kollagen III.
Normalerweise werden die Kollagene vollständig prozessiert, und zylindrische Fibrillen können sich bilden. Bei gewissen erblichen Krankheiten ist jedoch die N-terminale Prozessierung defekt. Man beobachtet die Bildung von nicht-zylindrischen Fibrillen.
Solche Defekte können durch die reduzierte Aktivität der Proteinase, bei der Dermatosparaxis ist die pN-Peptidase genetisch defekt, oder durch Mutationen im Spaltungsbereich der Propeptide, beim Ehlers-Danlos-Syndrom Typ VIIB ist die a2(I)-Kette genetisch verändert, entstehen.
Huhnes et al. (1989) untersuchten die in vitro-Fibrillenbildung von pN-Kollagen I und fanden dünne, blattartige Strukturen, die zwar in Längsrichtung d-Periodizität zeigten, jedoch bis zu einigen mm breit sein konnten. Die Dicke entsprach bei allen Strukturen etwa 8 nm.
Mischungen von Kollagen I und pN-Kollagen führten zu einer Reihe pleomorpher Fibrillen.
Auch Mould et al. (1990) fanden, daß Prokollagen I in genügend hoher Konzentration verschiedene Aggregate formen kann, wie z.B. d-periodische Bänder mit einer Dicke von etwa 8 nm und Breiten bis zu l mm. Durch immunohistorische Methoden konnten sie die Propeptide auf der Oberfläche dieser Staikturen lokalisieren. Wir vermuten, daß Prokollagene demzufolge die Bildung d-periodischer Anordnungen hemmen, aber verhindern sie nicht.
Die Amiantoidfibrillen, die im Trichterbrustknorpel auftreten, sind dünn und breit (Rupprecht et al.,1988). Deswegen vermuten wir, daß pN-Kollagen II, das sich nicht durch mangelhafte Prozessierung zu Kollagen II umsetzt, in solchen Fibrillen eingebaut ist.

iii) Regulation der Fibrillenbildung in vivo
Für die Regulation der Fibrillenbildung in vivo wurden verschiedene Mechanismen
vorgeschlagen:

1) Interaktion mit Proteoglykanen
2) Sequenz und Ausmaß der Prokollagen-Prozessierung
3) Interaktion von verschiedenen Kollagentypen.

Vogel et al. (1984) haben gezeigt, daß PG-S2 aus Sehnen an Kollagen I und II bindet und die Fibrillenbildung in vitro hemmt. Für das PG-S2 aus Knorpel konnte jedoch keine vergleichbare Hemmung festgestellt werden.
Hedbom und Heinegard (1989) zeigten mittels Trübungsmessungen, daß Fibromodulin aus bovinem Gelenkknorpel die Fibrillenbildung von nativen wie auch Pepsin-verdauten Kollagenen I und II hemmt. Fibromodulin interagiert demzufolge mit dem tripelhelikalen Bereich der Kollagene. Auch stellen sie eine größere Hemmung fest, wenn Fibromodulin und PG-S2 gleichzeitig den Kollagenen zugesetzt werden. Es scheint, daß die beiden Proteine eine synergistische Wirkung auf die Fibrillenbildung ausüben. Die veränderten optischen Daten in Anwesenheit von Fibromodulin weisen zudem auf die Bildung von strukturell verschiedenen Fibrillen hin.
Wir vermuten, daß der Existenz von Prokollagen formen zur Hypothese führten, daß die umfangreichen, größtenteils globulären Propeptide intrazellulär die Bildung von intakten Fibrillen verhindern und somit gut transportierbare Formen darstellen. Außerdem würden Prokollagene sich aber in der extrazellulären Matrix an wachsende Fibrillen anlagern, die Oberfläche blockieren und dadurch den Durchmesser der Fibrillen kontrollieren können.
Die Reihenfolge und die Kinetik der N- und C-terminalen Propeptid-Abspaltung durch die in der Matrix lokalisierten Proteinasen haben Einfluß auf die Fibrillenbildung in vivo (Kühn, 1987).
Die Interaktion zwischen verschiedenen Kollagentypen fuhren zur Regulation des Durchmessers der Fibrillen. Birk et al. (1990) konnten zeigen, daß die Interaktion von Kollagen I und V den Fibrillendurchmesser in vitro regu liert. Gereinigtes Kollagen V bildet in vitro dünne Fibrillen ohne erkennbare Periodizität. Breite Typ I-Fibrillen zeigen nebst ausgeprägtem Bandenmuster eine Streuung des Durchmessers. Pepsin-verdautes Kollagen V zeigt deutlich weniger Einfluß auf den Fibrillendurchmesser. Die N-terminale globuläre Domäne ist demnach für den regulatorischen Effekt essentiell.

1.3.2 Proteoglykane

Proteoglykane (PG) bilden nach den Kollagenen die zweithäufigste Komponente des Knorpelgewebes. Proteoglykane sind Glykoproteine, deren Polypeptidkette (Proteincore) mit einer oder mehreren Glykosaminoglykanketten kovalent verknüpft ist (Kjellén und Lindahl, 1991). Glykosaminoglykane (GAG) sind unverzweigte anionische Polysaccharidketten, die aus Disaccharideinheiten zusammengesetzt sind.
Man unterscheidet vier Hauptgruppen von GAG-Ketten:

1. Hyaluronsäure,
2. Chondroitinsulfat und Dermatansulfat,
3. Heparansulfat und Heparin
4. Keratansulfat.

Hyaluronsäure stellt in dieser Gruppe eine Ausnahme dar, weil es nicht sulfatiert ist und keine kovalente Verknüpfung mit einem Proteincore aufweist (Prehm, 1983). Proteoglykane, die mit Chondroitinsulfat-, Dermatansulfat- und Keratansulfatketten substituiert sind, haben vor allem strukturelle Bedeutung als Matrixproteoglykane (Fosang und Hardingham, 1996), und die mit Heparansulfatketten substituierten Proteoglykane erfüllen in der Regel eine Funktion als Co-
Rezeptoren auf der Plasmamembran der Zellen (Gallagher, 1996).

1.3.2.1 Hyaluronsäure bindende Moleküle

Der interfibrilläre Raum im Knorpel ist angefüllt mit großen Proteoglykanaggregaten, die durch die Bindung von Aggrecan an Hyaluronsäure entstehen.
Aggrecan ist das am häufigsten vorkommende Proteoglykan in der Knorpelmatrix.
Es besitzt ein roteinzentralfilament von etwa 210 kDa mit verschiedenen Domänen (Heinegard and Oldberg, 1993).

Im mittleren Teil seiner Polypeptidkette trägt das reife Proteoglykanmonomcr etwa 30 Keratansulfat- Glycosaminoglykanketten und ungefähr 100 Chondroitinsulfatketten
(Heinegard and Axelsson, 1977; Doege et al., 1987).
Das komplette Molekül erreicht eine molare Masse von über 3×106 Da. Außerdem weist das Zentralfilament noch N- und Overknüpfte Oligosaccharide auf.
Das Protein enthält zwei homologe globuläre Domänen (G1 und G2) im N-terminalen Teil der Peptidkette, sowie eine weitere globuläre Domäne (G3) im C-terminalcn Teil. (Paulsson et al., 1987). Die Gl-Domäne zeigt eine spezifische
Bindung an Hyaluronsäure (Heinegard and Hascall, 1974).
Die Funktionen der G2- und G3-Domäne sind nicht geklärt. Die Domänenstruktur des Aggrecans wird in der unten folgenden Abbildung gezeigt (Abb. 1.11).
Die Bindung von Aggrecan an Hyaluronsäure wird durch das Link-Protein verstärkt (Heinegard and Hascall, 1974).
Dieses knorpelspezifische Protein setzt sich aus drei Polypeptiddomänen zusammen und weist eine hohe Homologie zur G1-Domäne des Aggrecans auf (Neame et al., 1986).
Entlang eines Hyaluronsäuremoleküls können sich bis zu 100 Aggrecanmoleküle anlagern und so große Aggregate mit einer molaren Masse von 300-400×106 Da bilden.
Als weiteres Proteoglycan dieser Gruppe wurde Versican in artikularem Knorpel nachgewiesen, das allerdings in wesentlich geringerem Maße exprimiert wird als Aggrecan (Grover und Roughley, 1993).

1.3.2.2 Glykoproteine mit leuzin-reichen Motiven

Gemeinsames Merkmal dieser Proteinfamilie, die derzeit neun Mitglieder umfaßt, ist ein leuzin-reiches Strukturmotiv (Patthy, 1987), das in einer großen Anzahl unterschiedlichster Proteine gefunden wurde (Kobe und Deisenhofer, 1994). Die leuzin-reichen Motive (LRR: leuzine-rich repeat) haben eine Länge zwischen 20 und 29 Aminosäuren und weisen in dieser Sequenz mehrere konservierte Leuzinreste auf. Die größte Gruppe innerhalb der Proteinfamilie mit leuzin-reichen Motiven bilden die kleinen leuzin-reichen Proteoglykane (SLRP: small leucine-rich repeat proteins). Ausgehend von einem Vergleich der Sequenzen unterscheidet man drei Untergruppen innerhalb der Gruppe der SLRP (lozzo, 1997).
Die erste Untergruppe bilden Decorin (Krusius und Ruoslahti, 1986) und Biglycan (Fisher et al., 1989), deren Polypeptidketten zu 55% homolog sind. Beide Proteine besitzen im Nterminalen Bereich Substitutionsstellen für Glykosaminoglykanketten und haben eine zentrale Domäne mit leuzin-reichen Domänen. In den N- und C-terminalen Polypeptidsequenzen befinden sich Cysteinreste, die durch Disulfidbrücken verknüpft sind (Neame et al., 1989).
Beim Decorin ist ein Serinrest mit einer CS/DS-Kette glycosyliert, bei Biglycan sind hingegen zwei Serinreste substituiert.
Abhängig von der Epimerisierung handelt es sich bei der GAG-Kette entweder um eine Chondroitinsulfat- (mit DGlucuronsäure als Disaccharidkomponente) oder um eine Dermatansulfatkette (mit LIduronsäure).
Im Knorpel des Huhns wurde Biglykan nicht nachgewiesen. Allerdings kommt Decorin im Huhn offenbar in einer Ein- und Zweikettenform vor (Blaschke et al., 1996). Für Decorin ist in einigen Fällen eine Fibrillenbindung beschrieben worden (Pringle and Scott, 1990). Durch die Wechselwirkung mit Decorin wird in vitro die Fibrillenbildung
verzögert, und es werden dünnere Fibrillen gebildet (Vogel, 1984; Vogel und Trotter, 1987).
Weiterhin ist für den transformierenden Wachstumsfaktor-ß (TGF-ß: Transforming Growth Factor-ß) eine Bindung an Decorin beschrieben, und es wird angenommen, daß Decorin für diesen Wachstumsfaktor als Speicher in der extrazellulären Matrix dient (Yamaguchi et al., 1990).
Die zweite Untergruppe der kleinen leuzin-reichen Proteoglykane bilden Fibromodulin, Lumican, Keratocan und PRELP. Fibromodulin (Oldberg et al., 1989) und Lumican (Blochberger et al., 1992) sind Keratansulfatproteoglycane, die im N-terminalen Bereich des Proteins sulfatierte Tyrosinreste aufweisen und im mittleren Teil ihrer Polypeptidkette mit einer oder mehreren Keratansulfatketten substituiert sind.
Die Polypeptidketten der beiden Proteine zeigen eine zu 48% homologe Sequenz.
Für Fibromodulin wurde eine Wechselwirkung mit Fibrillen nachgewiesen, und zwar an den Positionen, die nicht von Decorin gebunden werden (Hedbom und Heinegard, 1993).
Dies ist möglicherweise ein Hinweis auf eine reziproke Funktion von Fibromodulin und Decorin.
Die zwei weiteren Proteoglykane dieser Gruppe, Keratocan und PRELP, zeigen eine 55%ige Sequenzhomologie. Keratocan besitzt ein Molekulargewicht von 38 kDa und sein
Proteincore ist mit bis zu drei Keratansulfatketten substituiert (Corpuz et al., 1996; Dunlevy et al, 1998).
Die cDNA von PRELP (proline-arginine-rich and leucin-rich repeat protein) wurde aus artikularem Knorpel kloniert (Bengtsson et al, 1995).
Besonderes Merkmal der Sequenz ist die Prolin- und Arginin-reiche N-terminale Domäne.
Im zentralen Teil der Polypeptidkette befinden sich drei mögliche Substitutionsstellen für Keratansulfatketten.
Die dritte Untergruppe besteht aus den Proteoglycanen Epiphycan, einem Dermatansulfatproteoglykan, das ursprünglich im Gliedmaßenknorpel embryonaler Hühner gefunden wurde (Shinomura und Kimata, 1992), und Osteoglycin, das in der Cornea vom Rind als Keratansulfatproteoglykan vorkommt (Funderburgh et al, 1997).
Als weiteres Glycoprotein mit leuzin-reichen Motiven kann hier noch das Chondroadherin (Neame et al, 1994) erwähnt werden.
Chondrozyten zeigen eine Adhäsion an Oberflächen, die mit diesem 36 kDa Protein beschichtet waren (Sommarin et al, 1989).
Mittlerweile wurde das Integrin a2ßl als Rezeptor für Chondroadherin identifiziert (Camper et al, 1997).

1.5 Transport und Funktion von Zinkionen

Bei unserer Arbeit haben wir eine mangelhafte Funktion von N-Prokollagen-Protease festgestellt, welche entweder auf die Zinkverarmung in Chondrozyten oder mangelhafte
Bindung von Zink an N-Prokollagen-Protease zurückgeführt werden könnte.
Zinkionen erfüllen in den Zellen verschiedene Funktionen. Sie sind Bestandteil und Cofaktor von mehr als 300 Enzymen (darunter die MMPs und die N- Prokollagen-Proteasen), wirken als Stabilisator biologischer Membranen und sind Bestandteil DNA-bindender Proteine (z. B.
Steroidrezeptoren).
Die Aufnahme von Zink in den Organismus erfolgt in Jejunum und Ileum. Im Blut wird das Zink dann an Plasmaproteine gebunden (besonders an Albumin), transportiert und zur
Aufnahme in die Gewebe wieder freigesetzt. Der Plasmazinkspiegel beträgt normalerweise 100-400 mg/100 ml (15-20 mmol/l). Der Mechanismus des Transports der Zinkionen in der
extrazellulären Matrix und durch die Zellmembran hindurch ist bisher noch nicht genau geklärt. Durch den Einsatz von radioaktivem Zink (65Zn) versucht man darüber Aufschluß
zu erhalten. Dabei hat man über den Transport in Enterozyten, Hepatozyten und Erythrozyten nur begrenzte Informationen gewinnen können. Die meisten Experimente
konzentrieren sich dabei auf den Transport von Zinkionen in Enterozyten. Die Kinetik des Transports von Zinkionen in diese Zellen gibt Hinweise auf eine schnelle Sättigung der
Zellen mit Zink (Ostreicher & Cousins, 1989). Die schnelle Sättigung der Enterozyten mit Zink ist wahrscheinlich auf die Assoziation der Zinkionen mit spezifischen
Transportproteinen in der Zellmembran zurückzuführen (Blakeborough & Salter, 1987).
Während Cadmiumionen den Transport von Zinkioncn in Enterozyten hemmen (Blakeborough & Salter, 1987; Tacnet et al., 1990), wird die Aufnahme in Erythrozyten durch Anionen wie Bicarbonat erleichtert (Kalfakakou & Simons, 1990).
Der Nachteil des Einsatzes von radioaktivem Zink (65Zn) ist jedoch, daß man bei der folgenden Radioaktivitätsbestimmung nicht unterscheiden kann, ob die Zellen die Zinkionen aufgenommen
haben, oder ob sie lediglich an die Zellmembran gebunden wurden. Eine Alternative zu dieser Methode ist der Nachweis von intrazellulärem Zink durch Zinquin (TSQ und (2- methyl-8-p-toluenesulfonamid-6-quinolyloxy) acetic acid), das an Zinkioncn bindet und damit einen fluoreszierenden Farbstoff bildet. Einen Nachteil bei diesem Verfahren stellt die
minimale meßbare Konzentration an freien Zinkionen dar, die im nanomolaren Bereich liegt. Die erwartete intrazelluläre Konzentration an freien Zinkionen liegt jedoch im pikomolaren Bereich. Außerdem ist noch nicht bekannt, ob und wie stark dieser Farbstoff an in der Zelle gebundenes Zink bindet.

1.6 Trichterbrust

Die Trichterbrust (Pectus excavatum) ist eine endogene Heinmungsmißbildung mit
bogenförmiger Einziehung des kaudalen Teils des Bmstbeins oder des Schwertfortsatzes im
Brustraum zwischen dem Centrum tendineum des Zwerchfells und der Thoraxvorderwand.
Die Kielbrust (Pectus carinantum) gehört zur gleichen Krankheitsgruppe (Robischek et al.,
1979).

Die Trichterbrust ist mit 90% die häufigste angeborene Deformität der Brust. Die Angaben
zur Inzidenz schwanken zwischen 0,03-3,5%. Erlangen, ein Zentrum für die Trichterbrustkorrektur, gibt die Inzidenz mit 0,85% an. Der männliche Bevölkerungsanteil ist 2-3mal häufiger als der weibliche betroffen.
In der Landbevölkerung kommt die Trichterbrust dreimal häufiger vor als in der Stadtbevölkerung (Krug, 1983; von der Oelsnitz, 1983).Ohne
es genauer bestimmen zu können, haben genetische Faktoren offensichtlich einen Einfluß.
Hinweise dafür bieten familiäre Häufung und die vermehrte Kombination mit Fehlbildungen der Wirbelsäule und/oder anderen Anomalien, wie z. B. Vituium cordis, Mitralklappenanomalien, Pulmonalagenesie, Hüftdysplasie, Hüftluxation, Schädelmißbildungen, Marfan-, Turner- und Pierre-Robin-Syndrom, Epilepsie (Von der Oelsnitz, 1983; Meister, 1982).

1.6.1 Klinik

Es werden klinisch gesehen vier Trichterbrust-Typen unterschieden (Hummer, 1985; Raithel et al., 1983; Willital, 1981):

a) symmetrisch-normal gewölbter Thorax:
Der Trichter umfaßt nur die unmittelbar sternalen Abschnitte des Brustkorbs b) asymmetrisch-axiale Torsion des Coipus sterni bei sonst normal gebautem Thorax:
Die Trichterwände sind unterschiedlich steil.
c) symmetrischer Platythorax:
Der sternovertebrale Abstand ist nicht nur im Trichter sondern im ganzn Sternumverlauf vermindert.
d) asymmetrischer Platythorax
Die Verkleinerung des intrathorakalen Raums führt zur Beeinträchtigung der mediastinalen Organe und zu einer signifikanten Häufung kardiopulmonaler Funktionsstörungen [Willital et Bürger, 1975].
Im EKG finden sich: Rechtsablenkung der elektrischen Herzachse, Pdextrokardiale, negative T-Wellen in den Brustwandableitungen, Rechtsverspätung und Rhythmusstörungen (Leutschaft et Geyer, 1968).

1.6.2 Pathogenese

Es existieren viele Hypothesen zur Pathogenese der Trichterbrust. Keine von ihnen gibt aber eine befriedigende Erklärung zur ihrer Genese.
Brown (1939) führte die Entstehung einer Trichterbrust auf einen verkürzten mediastinalen Bandapparat zurück, der eine Zugwirkung auf das Sternum ausübt.
Maneke (1959) behauptete, daß eine sternokostale Dysplasie mit funktioneller Fibroblasteninsuffizienz die Ursache einer Trichterbrust sei.
Sternum und Rippenknorpel seien durch eine intrathorakale Sogwirkung deformiert worden.
Geisbe (1967) zeigte im Tierexperiment, daß die mechanische Schädigung des Brustbeins beim Kaninchen durch inspiratorisches Druckgefälle zur trichterartigen Einziehung der
vorderen Brustwand führt. Die von ihm festgestellten histologisch regressiven Veränderungen deutete er als Folge vermehrter mechanischer Belastung bzw. als vorzeitige
Knorpelalterung (Geisbe et al., 1967 und 1972).
Leutert und Tischer (1968) vertraten die Auffassung, daß degenerierte Knorpelzellen, demaskierte kollagene Fasern und die Anhäufung saurer Mukopolysacharide im deformierten Rippenknorpel einer Trichterbnist keine krankhaften Veränderungen sind sondern altersbedingte Vorgänge, die normalerweise erst 5 Jahre später zu beobachten sind.
Andere Autoren waren der Meinung, die Thoraxdeformität beruhe auf einem übermäßigen Rippenwachstum, so daß es zu einer Ein- oder Ausstülpung des Brustbeins komme (Robicsek et al., 1979; Stauffer, 1976).
Kresse und Mitarbeiter (1969) kamen aufgrund biochemischer Untersuchungen zu dem Ergebnis, daß bei einer Trichterbrust ein Stoffwechseldefekt des Chondroitinsulfats vorliege.
Spurenelementanalytische Untersuchungen eines Trichterbrustknorpel (Rupprccht et al., 1987) ergaben einen hoch signifikanten Zinkabfall bei gleichzeitig erhöhtem Magnesiumund Calciumgehalt gegenüber einem gesunden Kontrollkollektiv.
Elektronemnikroskopische Untersuchungen zeigten, daß es zu einem vermehrten Auftreten von degenerativ veränderten Chondrozyten kommt.
Die Kollagenfibrillen sind abschnittsweise irregulär strukturiert und ähneln z.T. Amianthoidfibrillen. Daneben findet sich auch “long-spacing collagen” (Rupprecht et al., 1987; Rupprecht, 1990).
Die Anordnung dieses Kollagens zeigt eine sehr große Ähnlichkeit mit elcktronemnikroskopischen Darstellungen von Typ VI Kollagen (Bruns, 1984; Bruns et al., 1986; Keene et al., 1988; Lütjen-Drecoll et al., 1989).

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