Die Spätdifferenzierung der humanen Chondrozyten im Rippenknorpel,
Zinkmangel in Trichterbrustchondrozyten
und
die Differenzierung der Osteoblasten-ähnlichen Zellen in dreidimensionaler
Matrix
Inaugural-Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades
der Naturwissenschaften im Fachbreich Chemie und Pharmazie
der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Westfälischen Wilhelms-Universität Münster

Vorgelegt von Safarali Bahrami-Khondabi aus Isfahan

Dekan: Prof. Dr. Wulfhard Lange
Erster Gutachter: Prof. Dr. E. J. Verspohl
Zweiter Gutachter: Prof. Dr. Peter Bruckner

Die vorliegende Arbeit wurde unter Anleitung von Herrn Professor Dr. Peter Bruckner
in der Zeit von Juni 1994 bis Mai 1999 im Institut für physiologische Chemie und
Pathobiochemie der Westfälischen Wilhelms-Universität Münster durchgeführt.

Die Betreuung dgger vorliegenden Dissertation im Fachbereich Chemie und Pharmazie erfolgte
durch Herrn Professor Dr. E. J. Verspohl vom Institut für Pharmazeutische Chemie der
Westfälischen Wilhelms-Universität Münster

Die Spätdifferenzierung der humanen Chondrozyten im Rippenknorpel Knorpelmatrix besteht hauptsächlich aus Kollagen II, IX und XI und dem Proteoglycan Aggrecan. In mineralisiertem Knorpel finden sich zusätzlich knochenspezifische Moleküle wie alkalische Phosphatase, Osteonectin, Osteocalcin, Osteopontin und bone sialoprotein(BSP). Die Zusammenlagerung dieser Proteine wird durch Hydroxyapatit in der extrazellulären Matrix stabilisiert. Ferner bilden hypertrophierte Chondrozyten Kollagen X.
Treten Kollagen X, die alkalische Phosphatase und eine Proliferation der Knorpelzellen gemeinsam auf, ist dies ein Merkmal für die terminale Differenzierung des Knorpelgewebes.
Durch immunhistochemische und biochemische Analysen sowie die ultrastrukturelle Untersuchung wurde Kollagen X in der extrazellulären Matrix des Knorpelgewebes nachgewiesen und in Verbindung zum Prozeß der Mineralisation von Knorpelgewebe gebracht. Auch wenn man sich über das Vorkommen von Kollagen X nur in hypertrophierten Knorpel einig ist, bestehen dennoch gegensätzliche Hypothesen über dessen Funktion. Einerseits wird dem Kollagen X eine fördernde Wirkung auf die Mineralisierung zugeschrieben, da kollagen X sowohl an Bestandteile der Matrixvesikel, AnexinVI, Anexin V und alkalische Phosphatase als auch an Kalzium bindet (Wu et al.,1991). Andererseits wird angenommen, daß Kollagen X die Mineralisierung hemmt, weil es perizellulär in Form von Filamentfasern vorliegt, wo keine Mineralisierung statt findet.
Außerdem befindet sich Kollagen X in Eierschalen, die kein Hydroxyapatit aufweisen. (Arias et al.,1991; Schmid et al., 1991)
In unserer Studie haben wir die Spätdifferenzierung im Rippenknorpel während der Entwicklung der Chondrozyten untersucht. Für die Bestimmung der Differenzierung ist es notwendig, die Marker für die terminale Differenzierung im Gewebe und in der Zellkultur nachzuweisen. Frühere Untersuchungen an Rippenknorpel von Classen et al., (1996), Kämpen et al., (1996), und Bonucci et al., 1976, haben eine Spätdifferenzierung an Rippenknorpel ohne Kollagen X-Synthese, eine Degeneration der extrazellulären Matrix, Mineralisation (nach der Pubertät), alkalische Phosohatase-Aktivität (nach der Pubertät) und eine Korrelation der Mineralisation mit der Vaskula-risierung ergeben. Koebke und Saternus, (1982 & 1985) fanden eine reine Ossifikation ohne vorherige Mineralisation. Im 5 Diskussion 95 Gegensatz zu diesen Berichten in der Literatur haben wir Kollagen X sowohl in Zellkultur als auch im Gewebe (vor und nach der Pubertät) nachgewiesen. Außerdem haben wir alkalische Phosphatase-Aktivität und eine Mineralisation der extrazellulären Matrix sowohl im Rippenknorpel (nur nach der Pubertät) als auch in Zellkultur festgestellt. Daher schließen wir, daß alkalische Phosphatase für die Mineralisation essentiell ist.

Bei 5-jährigen Kindern wurde bereits Kollagen X synthetisiert, obwohl die Mineralisation erst nach der Pubertät einsetzt. Daher stellt sich die Frage, ob Kollagen X für die Mineralisation ebenfalls notwendig ist. Da nach der Pubertät auch die alkalische Phosphatase nachweisbar ist und damit die Mineralisation einsetzt, besteht die Möglichkeit, daß beide Faktoren (nicht Kollagen X alleine, sondern zusammen mit alkalischer Phosphatase) die Mineralisation induzieren. Das verzögerte Auftreten der alkalischen Phosphatase und Mineralisation läßt vermuten, daß die Expression von Signalen durch Kollagen X und/oder ALP reguliert werden.Daher empfiehlt es sich, die Konzentration im Rippenknorpel von zB.: TGFß und bFGF vor und nach der Pubertät zu messen, da diese Wachstumsfaktoren in der Lage sind, die Spätdifferenzierung zu inhibieren (Böhme et al., 1995). Da die alkalische Phosphatase und Mineralisation nur nach der Pubertät auftritt, sollte der Zusammenhang zwischen den Sexualhormonen und der Spätdifferenzierung näher untersucht werden.
Bei der serumfreien Kultivierung der Chondrozyten des Rippenknorpels in Agarose- Kultur haben wir festgestellt, daß 50ng/ml Thyroxin, l00ng/ml Insulin und l00ng/ml IGFl keine terminale Differenzierung einleitet. Bei sternalen Hühnerchondrozyten onnte dieses Hormon allerdings eine Spätdifferenzierung induzieren (Böhme et al., 1992). Des weiteren haben wir feststellen können, daß sowohl die C-terminale als auch N-terminale Domäne des Parathormons die terminale Differenzierung von humanen kostalen Chondrozyten einleitet.
Die C-terminale Domäne induziert in serumfreier Zellkultur die Kollagen X-Synthese nach einem Tag und eine erhöhte alkalische Phosphatase-Aktivität nach 13 Tagen. Deshalb könnte man vermuten, daß es einen Inhibitor gibt, der die alkalische Phosphatase-Aktivität blockiert und mit der Zeit nicht mehr exprimiert wird..
Bei der Kultivierung mit verschiedenen Konzentration von FKS wurde Proliferation der kostalen Chondrozyten, Vergrößerung der Zellen, alkalische Phosphatase-Synthese und Kollagen X-Synthese nur durch 10% FKS induziert. Da alkalische Phosphatase bei der Kultivierung mit 10% FKS in drei Tagen festzustellen ist, gehen wir davon aus, daß Negativkontrolle auf die alkalischen Phosphatase-Aktivität vermutlich durch Serumfaktoren aufgehoben wird. Es ist nicht ausgeschlossen, daß weitere Faktoren des FKS bei der Spätdifferenzierung eine Rolle spielen.
Es ist zu bemerken, daß die C-terminale Domäne des Parathormons im Gegensatz zu 10% FKS keine Proliferation und Vergrößerung der Chondrozyten induziert. Das bedeutet, daß Spätdifferenzierung der kostalen Chondrozyten in serumfreie Zellkultur durch Cterminale Domäne von PTH induziert wird (da die Zellen ALP und Kollagen X synthetisieren), ohne daß die Zellen größer werden und proliferieren. Bei der Zugabe von 1% FKS oder Insulin oder IGF1 in Zellkultur wurde festgestellt, daß das Volumen der Zellen zunimmt, ohne daß die Zellen Kollagen X und alkalische Phosphatase synthetisieren.

So vermuten wir, daß Proliferation und Vergrößerung der Zellen keine Merkmale der Spätdifferenzierung der kostalen Chondrozyten sind.
Wir haben bei elektronenmikroskopischen Untersuchungen beobachtet, daß Rippenknorpel nach der Pubertät nur teilweise ossifiziert. Es muß eine Negativkontrolle der endchondralen Ossifikation auf sehr späten Differenzierungsstadien geben. Diese Mechanismen verzögern die Ossifikation von Rippen über sehr lange Zeiträume, obwohl Hypertrophie nach dem Kriterium Kollagen X-Synthese im 5-jährigen Kind bereits vorliegt.

Zinkmangel in Trichterbrustchondrozyten Anhand der laborchemischen Analyse konnte eine „Zinkverarmung” und ein signifikanter Anstieg von Kalzium und Magnesium im brustwanddeformicrenden Rippenknorpel nachgewiesen werden. Elektronenmikroskopische Untersuchungen zeigen die vergrößerten Golgi-Apparate und das vermehrte endoplasmatische Retiku-lum, die eine erhöhte Stoffwechselleistung der Chondrozyten bedeuten (Habilitationsschrift, Dr. Rupprecht Universität Erlangen 1994). Jedoch zeigt sich im extrazellulären Raum eine irreguläre Struktur der Kollagenfibrillen, so daß von einer Störung in der Fibrillenbildung ausgegangen werden muß. Im Rippenknorpelgewebe junger Menschen sind die Fibrillen rundlich mit einem sehr einheitlichen Durchmesser von 17-20 nm zu finden. Rippenknorpel der Trichterbrustpatienten zeigen aber breite dünne Fibrillen so gennante „Amianthoidfibrillen” oder auch „Asbestfasern” (Habilitationsschrift, Dr. Rupprecht Universität Erlangen 1994). Solche Fibrillen treten auch bei Alterung des Rippenknorpels auf (Mallinger und Stockinger, 1988). Deswegen betrachtet man die Trichterbrustkrankheit als Voralterung des Rippenknorpels. Chun-lin et al., 1995 haben festgestellt, daß teilweise prozessiertes Prokollagen II (pN-Kollagen II) in einem Gemisch mit Kollagen II bei der Fibrillogenese die breiten dünnen Fibrillen verursachen. Der gleiche Phänomen haben Holmes et al., 1991 bei der Fibrillogenese eines Gemisches von Kollagen I und pNKollagen I gefunden.
Deswegen haben wir die Prozessierung von Prokollagen II untersucht. Wir haben die Aktivität der Prokollagen-N-Protease in Zellkultur der kostalen Chondrozyten verfolgt.
Dabei haben wir eine Verstärkung der Prozessierung des Prokollagens II durch Zinkzugabe (15mM ZnSO4) festgestellt. Dieses Ergebnis war bei den kostalen Chondrozyten normaler Probanden nicht zu finden. Außerdem haben wir die Zinkkonzentration in kostalen Chondrozyten von Patienten mit Brustwanddeformitäten und normalen Spendern laborchemisch durch Inductiely Coupled Plasma-Mass Spec-trometry (ICP-MS) gemessen.
Anhand der Untersuchung konnte eine „Zinkverarmung” und ein signifikanter Anstieg von Calcium in Chondrozyten bei Trichterbrustdeformitäten nachgewiesen werden. Diese Befunde scheinen eine mangelhafte Aktivität der Prokollagen-N-Protease zu belegen. Diese mangelhafte Aktivität des Enzymes konnte entweder durch die Verarmung der Zinkkonzentration in Chondrozyten von Brustwanddeformitäten oder andere Störung der Prokollagen-N-Protease (z.B die mangelhafte Bindung von Zink an Prokollagen-NProtease), erkälert werden. Die mangelhafte Aktivität der Prokollagen-N-Protease führt zu einer mangelhaften Prozessierung von Prokollagen II und somit zur Bildung von breiten und dünnen Fibrillen (Amianthoidfibrillen), welche zur Bildung „minderwertigen” Knorpels führt. Dieser kann den mechanischen Belastungen bei der In- und Expiration weniger standhalten und führt so zur einer Brustwanddeformitäten. In einer tierexperimentellen Studie konnte bei schwangeren Ratten mit Zinkmangel vergleichbare morphologische Befunde bei deren Jungen im Rippenknorpel nachgewiesen werden (Habilitationsarbeit von Dr. Rupprecht Uni. Erlangen 1994).
Beim Zinkmangel in Chondrozyten von Brustwanddeformitäten kann die Speicherung
von Zink, der Transport von Zink in extrazellulärer Matrix oder die intrazelluläre Aufnahme von Zink gestört sein.
Zinkionen werden von Trichterbrustchondrozyten-Kulturen intrazellulär aufgenommen und verstärken über die Prokollagen-N-Protease die Prozessierung von Prokollagen II in der extrazellulären Matrix. Desweiteren können Zinkionen bei diesen Kulturen mindestens bis 20 Tage gespeichert werden.

Bei den Gewebeproben des Rippenknorpels von Trichterbrustpatienten wurden die Zinkionen aber selbst nach 10 Tagen nicht intrazellulär in die Chondrozyten aufgen-nomen.
Für dieses Phänomen sind zwei Gründe denkbar:
a) freie Zinkionen sind bei den Gewebeproben nicht in der Lage, die extrazelluläre Matrix zu passieren, und/oder von Trichterbrustchondrozyten im Gewebe aufgenommen zu werden, sondern benötigen dafür ein Transportprotein.
b) Es gibt Liganden in der extrazelluären Matrix des Trichterbrustknorpel, die Zinkionen auffangen und dadurch den Zinktransport verhindern.
Unsere Aussagen über Zinkaufnahme, Zinktransport und Zinkspeicherung gelten für freien Zinkionen unter fest definierten in vitro-Bedingungen.
Die Differenzierung der Osteoblasten-ähnlichen Zellen in dreidimensionaler Matrix Die Osteoblasten-ähnlichen Zellen stammen von primär-mesenchymalen Vorläuferzellen, die als Hilfsmittel für diese Studie eingesetzt wurden. Während der folgenden 2- wöchigen Beobachtung der Monolayer-Kulturen zeigen die Zellen den morphologischen und biochemischen Charakter von Osteoblasten. Die Zellen synthetisieren extrazelluläre Proteine (Kollagen I,V) und alkalische Phosphatase, die für Knochengewebe typisch sind.
Die Produktion dieser Kollagene durch andere knochenbezogene Zellen in vitro wurde in früheren Studien dargestellt (Cohentanugi et al., 1996; Byers et al., 1999; Aubin 1999).
Außerdem produzieren die Zellen auch Kollagen III, welches nicht unbedingt spezifisch für Osteoblasten ist (Van der Rest, 1991). Dieses Protein ist jedoch in spezifischen Knochenbereichen, einschließlich der Kortikalknochen in der Nähe der pe-riostalen Oberfläche immunelektronenmikroskopisch identifiziert worden. Diese Beobachtungen stimmen mit der Aussage überein, daß einige Typen von Osteoblasten noch die Kapazität von mesenchymalen Vorläuferzellen in Bezug auf die Kollagen III-Synthese enthalten. Es
wurde darüber spekuliert, daß die Osteoblasten-ähnlichen Zellen ähnlich wie die spezialisierten Osteoblasten Varianten sind, welche in vivo in der Nähe von Kortikal- Knochen-Oberflächen vorliegen. Solche Zellen, die sich in tieferen Zonen befinden, weisen keine Fähigkeit zur Kollagen III -Synthese auf. Jedoch liefert die Umgebung in unserer Monolayer-Kultur keine Hinweise auf einen Fortschritt für eine Weiterdifferenzierung von Osteoblasten-ähnlichen Zellen. Aber es stabilisiert die Differenzierung von mesenchymalen Vorläuferzellen.
Frühere Studien zeigen klar, daß die Zellen von Hühner-Embryonen-Kalvaria in Chondrozyten differenziert werden können (Wong und Tuan 1995; Stringa und Tuan 1996).
Dieses chondrogene Potential besteht unter bestimmten Bedingungen, wie z.B. einer Umgebung mit wenig Kalzium (Jacenko und Tuan, 1995). Zusätzlich zu der Beobachtung der Embryonen-Kalvaria, welche ein pränatales System darstellt, stellen die aus dem Periost stammenden Osteoblasten-ähnlichen Zellen, die in dieser Arbeit verwendet wurden, einen Fall von chondrogenem Potential in vitro in einem postnatalen System dar.
Die Differenzierung der Chondrozyten ist abhängig von den strukturellen Eigenschaften der stationären Umgebung (Zell-Matix-Kontakte). Zellen in einer nicht-adhäsive Umgebung (Agarose-Gele), verhalten sich phänotypisch und biochemisch anderes als in einem adhäsiven Zustand (Kollagen I-Gel oder Monolayer-Kultur). Die Zell-Matrix- Wechselwirkung und die Bildung von geeigneten Matrix-Rezeptoren bestimmen die
Richtung der Differenzierungen.
Nach Überführung in Agarose-Kulturen verändern die Osteoblasten-ähnliche Zellen radikal ihren Phänotyp zu demjenigen von Chondrozyten. Sie nehmen eine runde Gestalt und andere ultrastrukturelle Merkmale von Knorpelzellen an und synthetisieren Kollagen II, aber nicht die Kollagene I und V, die typisch für die Osteoblasten-ähnliche Zellen sind. Die Zellen produzieren weder Kollagen X noch alkalische Phosphatase. Sie haben jedoch den Phänotyp von Chondrozyten in frühen Stadien der Reifung (Szüts u.a., 1998). Die Abschaltung der alkalischen Phosphatase-Synthese könnte sofort nach der Ablösung von Zellen stattfinden.
Die Osteoblasten-ähnlichen Zellen in Monolayer-Kulturen synthetisieren Kollagene I, V, III und alkalische Phosphatase. Die Zellen proliferieren und sehen wie die Osteoblasten aus.
Die Osteoblasten-ähnlichen Zellen lassen sich auch in Kollagcn I-Gel kultivieren. Die Zellen bleiben Osteoblasten-ähnlich und produzieren Kollagen I und V, alkalische Phosphatase und proliferieren radikal. Bemerkenswerterweise produzieren die Zellen kein Kollagen III, was als Zeichen für die  eiterdifferenzierung der Osteoblasten-ähnlichen Zellen im Kollagen I-Gel gerwertet werden kann. Wir vermuten, daß die Rezeptoren von Kollagen I eine Rolle bei der Abschaltung der Kollagen III-Synthese spielen. Die Zellen in 5 Diskussion 100 Kollagen I-Gel zeigen die typischen Eigenschaften von Osteo-blasten in tieferen Zonen von Kortikal-Knochen.
Zusammengefaßt, postulieren wir schließlich, daß die Kommunikation zwischen Zellen und extrazellulärer Umgebung eine große Rolle für die Bestimmung des Knochenzellen- Phänotyps und die Differenzierung von Zellen spielt. Zusätzlich und Gegensatz zu anderen dreidimensionalen Kultur-Systemen (Attawia u.a. 1995; Laurencin u.a.1996; Saad u.a.1998; El-Ghannam u.a.1997; Schoeters u.a. 1992; Casser-Bette u.a. 1990; Tsuang u.a. 1997), erlaubt unsere Kultur die lichtmikroskopische Beobachtung von Zellen während der Kultivierungs-Periode. Daher kann diese Kulturmethode als sinnvolles 3-D-Modell für das Studium von Differenzierungs-Potentialen der osteogenen Zellen dienen.