1.1 Bindegewebe

Das Binde- und Stützgewebe kommt ubiquitär im Organismus vor und wird aus Kollagenen und elastischen Fasern sowie aus Proteoglykanen aufgebaut. Bindegewebe, wie zum Beispiel Knorpel, Knochen, Sehnen, die Cornea und der Glaskörper des Auges entstehen ursprünglich aus dem Mesoderm im Laufe der Embryogenese.
Diese Binde- und Stützgewebe bestehen aus geweblichen Funktionseinheiten, die man im Knochen als Osteone und im Knorpelgewebe als Chondrone bezeichnet.
Diese sind reich an Interzellulärsubstanz, die auch als extrazelluläre Matrix gennant wird und eine wichtige Rolle bei der Aggregation, Organisation und und Spezialisierung der Zellen spielt. Wird eine solche gewebliche Funktionseinheit zerstört, so zieht diese zunächst die Umgebung, später auch den gesamten Gewebeverband in Mitleidenschaft.
Auf Grund dieses pathogenetisehen Prinzips erklärt sich auch die Tatsache, daß die Binde- und Stützgewebe auf Zellschädigungen mit verwandten Reaktionsmustern antworten.

1.2 Knorpel (Arten von Knorpel)

1.2.1.1 Der Faserknorpel

Der Faserknorpel kommt in den Zwischenwirbelscheiben, der Schambeinfuge und in den Menisken vor.
Der Zellanteil ist sehr niedrig. Auffällig sind die großen dichtgepackten Kollagenfasern in der extrazellulären Matrix.
Die Hauptfunktion dieses widerstandsfähigsten Knorpeltyps besteht in der Lastübertragung und Stoßdämpfung zwischen knöchernen
Skeletteilen.

1.2.1.2 Der elastische Knorpel

Den elastischen Knorpel findet man im äußeren Gehörgang, dem äußere Ohr und einigen Kehlkopfknorpeln. Er ist charakterisiert durch große elastische Fasern, deren Komponente Elastin diesem Knorpeltyp ein gelbliches Aussehen verleiht.
Der elastische Knoipel verknöchert normalerweise nicht und ist nicht regenerierbar.
1.2.1.3 Der hyaline Knorpel
Der hyaline Knorpel ist mengenmäßig am bedeutendsten. Er bildet das embryonale Skelett, den sternalen und dorsalen Teil der Rippen, das Nasenseptum, Teile des Kehlkopfes, die Knorpelspange der Luftröhre und der großen Bronchialäste sowie die Gelenkoberflächen.
Er zeigt ein milchig glasiges Aussehen. Seine Matrix enthält Fasern, die aber weder makroskopisch noch nach geeigneter Anfärbung in lichtmikroskopischer Histologie zu erkennen sind. Elektronenmikroskopisch sind jedoch typische gebänderte Fibrillen zu erkennen, die sich je nach Vorkommen in teritorialen Matrixzonen in der Nähe und in interterritorialen Zonen weiter von den Zellen entfernt, in ihrer Dicke und Ausprägung des Bandenmusters unterscheiden. Schwerpunkt dieser Arbeit ist hyaliner Knorpel.

1.2.2 Knorpelentwicklung

1.2.2.1 Embryonale Skelettentwicklung

Drei embryonale Zellstrukturen bilden das frühe Skelett. Die Neuralleiste, eine Gewebestruktur ektodermalen Ursprungs, bildet den Branchialknorpel und den Schädelknochen.
Die anderen Skelettstrukturen entwickeln sich aus mesodermalen Geweben. Die aus den Ursegmenten (Somiten) hervorgehenden Anlagen der Wirbelsäule, die sogenannten Sklerotome, entwickeln das axiale Skelett. Das Extremitätenskelett entsteht aus den chondrogenen Vorläufern des lateralen Plattenmesodenn (Oasen et al., 1996).
Die Herausbildung der Gliedmaßenknospen beim Hühnerembryo ist ein sehr gut studiertes System der Chondrogenese und Entwicklung des Extremitätenskeletts. Von Hamburger und Hamilton (1951) wurde die 21-tägige Entwicklung des Hühnembryos im Ei nach morphologischen Kriterien beschrieben und in 46 Entwicklungsstufen unterteilt.
Die Gliedmaßenknospen bilden sich nach etwa 51- stündiger Embryonalentwicklung beziehungsweise auf der 15. Entwicklungsstufe nach Hamburger und Hamilton (HH15).
Durch das Zusammenwirken der Zone der polarisierenden Aktivität, des apikalen ektodermalen Grats und des dorsalen Ektoderms wird das Entwicklungsmuster in der frühen Gliedmaßenknospe gesteuert (Tickle und Eichele, 1994). Transplantationsstudien haben gezeigt, daß die Information über die anatomische Entwicklung der einzelnen Strukturen schon in den Gliedermassen der sehr frühen Entwicklungsstadium selbst enthalten ist (Koyama et al., 1996; Harison et al., 1918).
Hierbei spielen die Transkriptionsfaktorcn der Homöoboxgene für die Polarität des entwickelnden Gewebes eine zentrale Rolle (Tabin 1991). Außerdem haben lösliche Signal-Faktoren wie die TGF-ß- und FGF-Familie, Bedeutung für die komplexe Regulation dieser Gliedmaßenentwicklung. Der erste Schritt der skelettalen Morphogenese ist die Induktion des undifferenzierten Mesenchyms und die Bildung des kondensierten Mesenchyms, das schließlich zu den knorpeligen Skelettanlagen differenziert.

1.2.2.2 Chondrogenese

Die Gliedmaßenknospe besteht aus mesenchymalen Zellen, die mit Ektoderm bedeckt sind.
Die mesenchymalen Zellen produzieren Kollagen I und Kollagen III, Fibronectin, und kleine Mengen von Proteoglykanen. Die Chondrogenese beginnt, wenn prächondrogene mesenchymale Zellen anfangen, sich dicht zusammen zu lagern. Zu diesem Zeitpunkt beginnen die Zellen Aggrecan und Kollagen II anstelle von Kollagen I und Kollagen III zu produzieren (Von der Mark, 1980; Ede und Shamslahidjane,1983).
Kurz danach produzieren die Chondrozyten während der Chondrogenese Kollagen XI und Kollagen IX, Proteoglykane, Linkprotein und einige nicht-Kollagene Matrixproteine. Die Differenzierungssignale, die für die Knorpelbildung verantwortlich sind, können zum einen durch entwicklungsbiologische Untersuchungen und zum anderen mit Zellkulturstudien näher aufgeklärt werden.
Die Untersuchung induktiver Signale für die Chondrogenese setzt voraus, daß man pluripotente mesenchymale Zellen (die kondensierenden mesenchymalen Zellen, die für verschiedenen Entwicklungswege, z.B. Fett, Muskel und Knorpel entscheiden können) untersuchen kann, deren Entwicklungsweg noch nicht festgelegt ist.

1.2.2.3 Mesenchymale Stammzellen und Zellinien

Verschiedene Zellkultursysteme sind zur Kultivierung von mesenchymalen Vorläuferzellen etabliert worden. Bei Untersuchungen mit mesenchymalen Vorläuferzellen hat man festgestellt, daß diese pluripotent, d.h. myogen, osteogen, chondrogen und adipogen sind.
Diese Hypothese hat man experimentell mit embryonalem Gewebe, zum Beispiel Gewebe der Gliedmaßenknospen (Koniecny und Emerson, 1984; Grigoriadis et al. 1988) im Knochenmark (Berry 1992) und im Periostium (Nakase 1993) bestätigt. Die mesenchymalen Vorläuferzellen können bei der embryonalen Zellinie C3H10T 2 aus Mäusen (Taylor and Jones, 1979), der multipotenten mesenchymalen Zellinie RCJ 31 (Grigoriadis et al., 1989), sowie bei der skelettalen Zellinie CFK2 (Bernier und Goltzman, 1993) zu Knorpelzellen differenzieren. Außerdem ist die Isolierung von chondrogenen Zellinien aus Teratokarzinomen (Darmon et al.,1984, Atsumi et al., 1990) und aus Chondrosarkomen (Mukhopadhyay et al., 1995) beschrieben. Weiterhin gibt es noch die immortalisierte Zellinie, wie wT 2- Klone (Wang et al., 1993 ) und die aus Teratokarzinomen stammende Zellinie Cl.
Bei dieser Zellinie können durch Zugabe von 10-6 M Dexametason 80% die Zellen in Kultur zu Chondroblasten-ähnlichen Zellen differenzieren, während die Zellen unter der Wirkung anderer Signale zu Adipozyten oder Osteocyten differenzieren. Die nicht induzierten Zellen verkörpern offenbar eine stabile mesenchymale Vorläuferzellinie, die ihre Multipotenz bewahrt (Poliard et al., 1995).

1.2.2.4 Regulation der Chondrogenese

Zell-Zell-Kontakte, Zell-Matrix-Wechselwirkungen und diffundierende Faktoren spielen eine regulierende Rolle bei der Chondrogenese. Bei der Chondrogenese liegen die Zellen in Gruppen vor (Ahrens et al., 1977). Während der Zellkondensation zeigten Mackie et al., 1987 eine Expression von Tenascin und dessen Beteiligung an der Chondrogenese. Für verschiedene Matrixmoleküle wurde eine transiente Expression beobachtet, was auf eine mögliche funktionelle Bedeutung dieser Moleküle hinweist. Dazu zählen Fibronectin (Tomasek et al., 1982; Kulyk et al., 1989) und Versican (Kiinata et al., 1986), die im Verlauf der Chondrogenese stark exprimiert sind. Die Wechselwirkungen spezieller Zelloberflächenmoleküle vermitteln die Zell-Zell-Kontakte. Anti-Syndecan-3-Antikörper können in Zellkulturen die Kondensation der Knorpelvorläuferzellen wirksam unterdrükken (Seghatoleslami und Kosher. 1996). Die Expression der Zelladhäsionsmoleküle NCAM (neural cell adhäsion molecule) und der Ca2+-abhängigen N-Cadherine beeinflussen die Kondensation der Vorläuferzellen (Tavella et al., 1994, Widelitz et al., 1993). Durch Applikation von Antikörpern, die spezifisch mit dem N-Cadherin reagierten, konnte in der Kultur die Chondrogenese unterdrückt werden (Oberlender und Tuan, 1994). Zanetti und Solursh, (1984) stellten bei Untersuchungen an Zellkulturen aus Gliedmaßenknospen des Huhns fest, daß die Änderung der Zellmorphologie durch experimentelle Manipulation des Zytoskeletts eine weitere Voraussetzung für die Knorpeldifferenzierung darstellt.
Durch Störung des Aktinzytoskelettbildung mit Cytochalasin rundeten sich die Zellen ab. Statt einer langgestreckten, abgeflachten und einer für adhärierende Zellen typischen Morphologie weisen die Zellen mit Knorpeleigenschaften eine abgerundete Gestalt auf. Daß diffundierende Signale ebenfalls eine wichtige Rolle spielen, konnte besonders für Vertreter der TGF-ß Familie wie Aktivin ( Jiang et al., 1993) und bone morphogenetic protein 2 und 4 (BMP ) (Chen et al., 1991) in Experimenten an Gliedmaßenknospenzellen in Kultur gezeigt werden.

1.2.2.5 Differenzierung von norpelzellen

Im heranwachsenden Organismus wird das Knochenbildung und Knochen längen Wachstum durch einen Differenzierungsprozeß der Chondrozyten in der epiphysären Wachstumsfuge erreicht, der als Knorpelspätdifferenzierung bezeichnet wird (Poole, 1991).
Chondrozyten zeigen auf charakteristische Weise in vitro und in vivo für weitere Differenzierung eine phenotypische Flexibilität. Die Differenzierung verläuft von mesenchymalen Vorläuferzellen, über Ruhe- und proliferienden Chondrozyten bis hin zu schließlich hypertrophen Chondrozyten. Die Knochengewebe ersetzen den größten Teil des Knorpelgewebes durch endochondrale Ossifikation. Nur ein gringer Teil bleibt als Gelenkknorpel an den Enden der Röhrenknochen erhalten. Unter physiologischen Bedingungen verharren diese Knorpelzellen in einem niedrigen Enddifferenzierungszustand.
Lediglich bei pathologischen Veränderungen kommt es zur Weiterdifferenzierung.
Beispielsweise lassen sich bei degenerativen Knorpelerkrankungen in Nachbarschaft zum geschädigten Gelenkknorpel proliferative und hypertrophe Chondrozyten nachweisen (von der Mark, 1992).

1.2.3 Die Wachstumsfuge

Die Wachstumfuge ist eine spezielle Form von hyalinem Knorpel, die für das skelettale Längenwachstum verantwortlich ist.
Sie ist eine kleine scheibenförmige Verbindung Stelle zwischen Epiphyse und dem Ende der Diaphyse von Röhrenknochen.
Diese epiphysäre Wachstumfuge wird in verschiedene Zonen unterteilt (Hunziker et al., 1987).

In der Ruhezone befinden sich die Ruhechondrozyten, die eine abgeflachte Form haben und kaum metabolisch aktiv sind. Die Ruhechondrozyten sind klein und liegen einzeln oder paarweise vor.
In der proliferativen Zone teilen sich die Knorpelzellen, werden größer und ordnen sich dabei säulenartig in der Längsachse des Knochens an. Dieses wird als klonale Expansion in Richtung Diaphyse bezeichnet. Die Chondrozyten in dieser Zone synthetisieren überwiegend die im Knorpel vorkommenden Kollagene II, IX und XI, sowie das Knorpelproteoglykan Aggrecan. Die Chondrozyten in der unteren Proliferationszone weisen mehr endoplasmatisches Retikulum, einen größeren Golgi-Apparat und mehr sekretorische Vesikel auf. In der Matrix der Proliferationszone kommen Matrixvesikel (100-200nmÆ) vor, deren Funktion noch unvollständig verstanden ist. Sie befinden sich in diesem Falle in nicht-mineralisierter Knorpelmatrix. In der hypertrophen Zone stellen die Chondrozyten ihre Proliferation ein und steigern ihre metabolische Aktivität, so daß die Zellen mehr Matrix produzieren, größer werden und mehr auseinander driften. In dieser Zone produzieren die Chondrozyten Kollagen X, das charakteristisch für hypertrophe Chondrozyten ist. Im weiteren Verlauf wird die Zellmatrix der hypertrophen Chondrozyten
kalzifiziert. Die Mineralisierung beschränkt sich auf eine schmale Schicht hypertropher Chondrozyten in direkter Nachbarschaft zum subchondralen Knochen. Auch hypertrophe Chondrozyten produzieren Matrixvesikel. Diese Variante von Matrixvesikcln enthalten Annexin V, alkalische Phosphatase, Aktin und eine große Menge Calcium (Kirsch und Wuthier, 1994) und sind die Ausgangspunkte für die Mineralisierung. Die endothelialen und osteoblastischen Zellen wandern aus dem subchondralen Knochen in die zurückgelassene Matrix ein. Der Knorpel wird schließlich bis zum Ende der Reifung des Organismus vollständig durch Knochen ersetzt. Untersuchungen von Hunziker et al., (1987) an Wachstumsfugen von Ratten haben gezeigt, daß ein Chondrozyt diesen Weg von der Ruhezellen- über die proliferative Phase bis zum hypertrophen Stadium in 3-4 Tagen durchläuft. Das Längenwachstum der Röhrenknochen findet hauptsächlich durch Zeltlung der Chondrozyten in der Proliferationszone, aber auch durch Volumenzunahme und die
Matrixproduktion der Chondrozyten in der Proliferations- bzw. Hypertrophiezone statt.
Bei einem Knochenbruch sind undifferenzierte Mesenchymalzellen aus dem Perichondrium in der Lage, den Spalt zwischen den Knochenfragmenten zunächst mit Knorpel zu füllen. Der
entstehende Knorpelkallus legt sich als spindelförmige Verdik-kung um den Bruch und füllt die Lücke zwischen den beiden Knochen fragmenten aus. Die Resorption des Knorpelkallus und dessen Ersatz durch Knochengcwebe erfolgt durch den Prozeß der endochondralen Ossifikation.

1.2.4 Struktur und Funktion von Gelenkknorpel

Der Gelenkknorpel ermöglicht durch seine elastischen und stoßdämpfenden Eigenschaften eine reibungsarme Übertragung der durch das Skelett ausgeübten Kräfte und erleichtert die
Artikulation. Der ausdifferenzierte, adulte Gelenkknorpel hat keine Blutgefäße und Nerven.
Die Versorgung der Zellen findet durch Diffusion der Nährstoffe aus der Synovialflüssigkeit des Gelenkes und dem subchondralen Knochen statt. Der Gelenkknorpel liegt von der Oberfläche bis zum Knochen in drei nicht-mineralisierten Zonen vor:

a) die Tangentialzone
b) die Übergangszone
c) die Radialzone und eine mineralisierte Zone (Abb.

1.4). Am oberen Teil der Tangentialzone befinden sich keine Chondrozyten.
Die Chondrozyten im unteren Teil der Tangentialzone sind spindelförmig, flach und ellipsoid.
Die Chondrozyten in der Radialzone sind eiförmig und größer. Die Stammzellen in der Tangentialzone diffundieren in die Übergangszone.
Im oberen Breich der Radialzone proliferieren die Chondrozyten. Durch weitere Differenzierung in der mittleren und unteren Radialzone erfahren die Zellen eine Größenzunahme und bilden die erwähnten Säulenstrukturen aus. An die Radialzone schließt sich zum subchondralen Knochen hin eine mineralisierte Zone an.
Diese ist scharf begrenzt. Ihr oberes Rand wird deshalb als Tidemark bezeichnet. Sowohl Proliferation als auch die Säulenbildung sind aber im Gelenkknorpel deutlich weniger ausgeprägt, als in der Wachstumsfuge.

1.2.5 Weiterdifferenzierung

Es gibt Tür die Weiterdifferenzierung eines hypertrophen Chondrozyten zahlreiche Hinweise von einer direkten Transdifferenzierung von Chondrozyten zu Osteoblasten. Lian et al., (1993) und Strauss et al., (1992) fanden die Knochenproteine Osteocalcin und Osteopontin in Zellkulturen von späthypertrophen Chondrozyten. Ebenfalls konnte gezeigt werden, daß epiphyseale Hühnerchondrozyten, die bereits in vitro hypertroph waren, nach Transfer zu adhärenten Kulturbedingungen zu Osteoblasten-ähnlichen Zellen weiterdifferenzierten (Descalzi Cancedda et al., 1992, Gentili et al., 1993). Am Ende der Spätdifferenzierung teilen sich hypertrophe Chondrozyten noch einmal. Sinn dieser
Zellteilung ist, den Tochterzellen die Gelegenheit zur weiteren Differenzierung in Osteoblasten zu verleihen. Die Zellzahlverdoppelung als solche ist zu diesem Zeitpunkt jedoch nicht mehr benötigt. Aus diesem Grunde schalten die nicht weiter notwendigen Zellen das Programm des aktiven Zelltodes (Apoptose) ein (Roach et al., 1995). Außerdem gibt es
noch Hypothese, die erst einen apoptotischen Zelltod vorschlägt, nach welchem die Osteoblasten, die entweder aus dem Perichondriiim oder aus Gefäßen stammen, die Chondrozyten dannach ersetzen.

1.2.6 Knochenbildung

Die Chondrozyten werden hypertrophiert und synthesieren Kollagen X und alk. Phosphatase.
Im interzellulären Raum fängt es an zu mineralisieren , wodurch die Permeation der Nährstoffe praktisch unterbrochen wird, sodaß die Chondrozyten zugrunde gehen.
Das hyalinknorpelige Primordialskelett wird langsam bis auf wenige knorpelig bleibende Abschnitte ( Gelenkknorpel, Rippenknorpel, usw.) durch Knochen ersetzt. Diese Art von Knochen, die das Knorpelmaterial nach seiner Degeneration ersetzen, nennt man Ersatzknochen (indirekte Ossifikation). Die Knochen, die direkt von mesenchymalen Vorläuferzellen abstammen, bezeichnet man als Bindegewebsknochen (direkte Ossifikation). Die Osteoblasten stammen aus osteogenetischen Stammzellen, die ihrerseits aus Mesenchymzellen hervorgehen. Die Osteoblasten sezernieren Osteoide.

1.2.6.1 Desmale Ossifikation

Die Mesenchymzellen vermehren sich an bestimmten Stellen reichlich und differenzieren zu osteogenetischen Stammzellen und Osteoblasten. Es treten Kollagenfibrillen auf, die sich bündeln und durch flechten; ferner kommt es zu einer stockenden Vaskularisierung. Mit der Bindung der Grundsubstanz entsteht dann ein Osteoid.
Aus Osteoiden entsteht durch Verkalkung Knochen. Dieser so genannte Geflechtknochcn wird schon beim Kind durch Lamellenknochen ersetzt. Das zell- und gefäßreiche primäre Knochenmark liegt zwischen Knochenbälkchen, die Oseozyten enthalten. An der Oberfläche von Knochenbälkchen sind Anbau- und Abbauvorgänge der Osteoide zu erkennen.

1.2.6.2 Chondrale Ossifikation

Unter chondraler Ossifikation versteht man perichondrale und enchondrale Ossifikationen.
Enchondrale Ossifikation läuft grundsätzlich wie desmale Ossifikation. Bei der endchondralen Knochenbildung kommt es zuerst zur Ablagerung von Ersatzknochen (indirekte Ossifikation).
Nun dringt am Ort der späteren Foramina nutrica vor der Cambrium-Schicht gefäß- und zahlreiches junges Bindegewebe durch die Knochenmanschette hindurch in den verkalkten Knorpel ein. Dabei wird die Knorpelzwischensubstanz durch Chondrozyten, die mit den später zu besprechenden Osteoklasten identisch sind, aufgelöst.Dadurch entsteht ein großer Hohlraum,
die sogenannte primäre Markhöhle, die nachher das primäre Knochenmark enthält. Das primäre Knochenmark enthält sowohl Osteoblasten als auch Osteoklasten.

1.3 Die extrazelluläre Matrix

Die funktionellen Eigenschaften des hyalinen Knorpels sind abhängig von der molekularen Struktur jedes seiner Bestandteile, ihrer Konzentration im Gewebe, und ihren Wechselwirkungen.
Die große Bedeutung der extrazellulären Matrix im Bindegewebe erfordert eine genauere Beschreibung der beteiligten Moleküle.
Den Hauptbestanteil der Matrix bilden Kollagene und Proteoglykane.
Die bis heute bekannten 22 Kollagentypen stellen eine heterologe Gruppe verwandter Proteine dar. Sie sind ein wichtige Bestandteil der Fibrillen in extrazellulären Matrix.
Proteoglykane setzen sich aus Polysaccharid- und Proteineinheiten zusammen. Durch die hohe negative Ladung der Polysacharidseitenketten beeinflussen Proteoglykane maß geblich die viskoelastischen Eigenschaften der extrazellulären Matrix. Neben Kollagenen und Proteoglykanen kommen weitere Proteine, wie die großmolekularen Glykoproteine Fibronektin, Laminin, Tenascin sowie Elastin vor. Fibronektin, ein nicht-kollagenartiges Protein, ist in der Lage, Mikrofasern zu bilden. Durch die Fähigkeit, sowohl an Zellen wie auch an Matrixproteine binden zu können, ermöglicht Fibronektin den Zellen die Wechselwirkung mit der extrazellulären Matrix. Tenascin bildet einen sechsarmiges, sternförmiges Oligomer in der extrazellulären Matrix. Es handelt sich um ein Protein, das Zellmatrixwechselwirkungen beeinflußt. Es vermittelt sowohl Zelladhäsion als auch Zellabstoßung und kann an Proteoglykane und Fibronektin binden. Die Expression von Tenascin ist eng gekoppelt an
morphogenetische Ereignisse, wie embryonale Zellwanderung, Wundheilung und Tumorbildung.

1.3.1 Kollagen

Der Begriff Kollagen leitet sich aus dem Griechischen ab (kolla – Leim, und genoV- Geburt). Rund ein Viertel des Gesamtproteingewichtes bei Säugetieren bilden die Kollagene. Sie kommen bei allen mehrzelligen Organismen vor und bilden die wichtigsten faserigen Bestandteile der Haut, der Knochen, der Sehnen, der Blutgefäße, der Zähne und des Knorpels. Was Kollagene von anderen Proteinen unterscheidet, ist die tripelhelikale Struktur. Kollagenmoleküle bestehen aus drei mit der Aminosäuresequenz (Gly-X-Y)n zusammen rechtshändig verdrillten Polypeptidketten, sogennanten a-Ketten (Rieh und Crick, 1961). Jede a-Kette entspricht in ihrer Struktur einer linkshändigen Polyprolinhelix, die durch den hohen Anteil an Aminosäuren stabilisiert ist (Segal et al., 1969 ).
Prolin besetzt häufig die X-Position und Hydroxyprolin findet sich oft in der Y-Position.
Kollagene bestehen entweder aus drei gleichen Polypeptidketten (Homotrimer) oder aus zwei oder drei unterschiedlichen Polypeptidketten (Heterotrimer). Das Auftreten eines Glycinrestes an jeder dritten Position ist für die helixförmige Struktur der Kollagene unabdingbar, weil keine anderer Aminosäureseitenkette als ein Wasserstoffatom im dicht gepackten Zentrum der Tripelhelix ausreichend Platz findet.
Die Kollagenmleküle bilden, zum Teil mit anderen Kollagentypen oder Molekülen, supramolekulare Aggregate in der extrazellulären Matrix. Eine besondere Eigenschaft ist die Bildung fibrillärer Strukturen. Basierend auf diesen Polymeren Strukturen werden die Kollagentypen in verschiedene Klassen eingeteilt. Es ist allerdings eher der Fall, daß bestimmte Kollagentypen einzigartige Suprastrukturen mit spezieller Aufgabe bilden und somit eine Klasse für sich darstellen. Außerdem hat sich gezeigt, daß Fibrillen des Bindegewebes eine komplexe Struktur aufweisen und aus unterschiedlichen Komponenten zusammengesetzt sind, die nicht isoliert betrachtet werden können (Review, Prockop and Kivirikko 1995).
Die wichtigen fibrillenbildenden Kollagene sind die Kollagene I, II, III, V und XI, die eine Länge von ungefähr 300 nm und im zentralen Teil eine große tripelhelikale Domäne mit etwa 1000 Aminosäuren in jeder Kette aufweisen (van der Rest und Garrone, 1991). Die fibrillenbildenden Kollagene werden als Prokollagene sezerniert und bestehen zu diesem Zeitpunkt aus einer großen tripelhelikalen Domäne (mit 1009 bis 1029 Aminosäure resten in jeder Kette), die über kurze Telopeptide (15-26 Aminosäurereste) mit N- und CPropeptiden verbunden sind (Kühn, 1987). Die C-Propeptide (244-246 Aminosäuren) der fibrillenbildendcn Kollagene sind stark homolog und erhalten Informationen für die Initiation der Tripelhelixfaltung (Doege und Fessler, 1986). Die N-Propeptide haben eine kurze tripelhelikale Domäne (41-105 Aminosäuren), der sich eine nicht tripelhelikale Nterminale Domäne von variabler Größe und Struktur anschließt (7-407 Reste). Nach Abspaltung der Propeptide im Extrazellulärraum durch spezifische Endoproteinasen können sich die Kollagenmoleküle aneinanderlagern und Fibrillen bilden. Es gibt außerdem FACIT-Kollagene (fibril associated collagens with interrupted triple helices), die unterbrochene Teripelhelixes aufweisen und zu denen die Kollagentypen IX, XII, XIV, XVI und XIX zählen (Shaw und Olsen, 1991). Bisher hat man die Kollagenmoleküle II, VI, IX, X, XI, XIV und XVI, von denen die Kollagene II, IX, X und XI besonders wichtig sind, im Knorpel gefunden.
Kollagen X und VIII enthalten eine kurze tripelhelikale Domäne (140 nm).

1.3.1.1 Die Biosynthese und Sekretion von Prokollagen

Die Synthese der Kollagene (Abb.l.6A) soll am Beispiel des am besten untersuchten fibrillenbildenden Kollagens I gezeigt werden. Kollagen II und III scheinen auf ähnliche Weise prozessiert zu werden. Die einzelnen Polypeptidketten werden als große Vorläufermoleküle, pro-a-Ketten, an den Ribosomen des rauhen endoplasmatischen Retikulum synthetisiert und in das Lumen des endoplasmatischen Retikulum sezerniert. Während der Translation werden Prolin- und Lysinreste durch Enzyme, Prolyl- bzw Lysyloxidase, hydroxyliert. Hydroxylysin kann durch Glykosylierung weiter modifiziert werden.
Nach abgeschlossener Translation der Polypeptidketten vom Ribosom kommt es zur Bildung von Disulfidbrücken zwischen den C-terminalen Enden der Peptidkettcn. Die aggregierten CPropeptide funktionieren als Keim der Tripelhelixfaltung, die in Richtung des aminoterminalen Endes fortschreitet. Nach beendeter Faltung der Tripelhelix finden keine weitere Hydroxylierungs- und Glykosierungsmodifikationen an den einzelnen Ketten mehr statt.

1.3.1.2 Prozessierung von Prokollagenen im extrazellulären Raum

Die Strukturen von Prokollagenen und ihren Prozessierungs-Zwischenprodukten (pNKollagen, pC-Kollagen und Kollagen) werden in Abb.l.7A,D gezeigt. Aufnahmen von isolierten Prokollagenmolekülen und pN-Kollagenen der Fibrille konnten zeigen, daß sich das pN-Propeptid über dem tripelhelikalen Bereich zurück faltet (Abb.l,7B). Der biologische Grund für das Zurückfalten des Prokollagens ist noch nicht geklärt.
Man vermutet, daß dieses Phänomen an der Prozessierung des pN-Kollagens und der Regulation der Kollagenfibrillenmorphologie beteiligt sein könnte. Sequenzanalysen zeigen die Stabilität der pN-Kollagenkonformation durch intramolekulare (hydrophobe und hydrophile) Wechselwirkungen (R.B.Watson 1993).
Die Prokollagen-Proteasen sind im wesentlichen verantwortlich für die Umsetzung von Prokollagen zu Kollagen, das sich im extrazellulären Raum zu Fibrillen assoziiert.
Die Prokollagen N-Protease schneidet das N-Propeptid von Prokollagen I, II und III an der spezifischen Stelle des Substrates. Die Prokollagen-N-Protease katalysiert die Umsetzung vom Prokollagen zum pC-Kollagen und vom pN-Kollagen zum Kollagen. Die Prokollagen- C-Peptidase katalysiert die Umsetzung vom Prokollagen zum pN-Kollagen und vom pCKollagen zum Kollagen.

1.3.1.3 Die Haupt-Kollagentypen des Knorpels

i) Kollagen II
Kollagen II ist ein homotrimeres Molekül, das sich aus drei a1 -Ketten zusammensetzt [a1(II)]3, von denen jede 1050 Aminosäuren enthält. Mit einem Anteil von mindestens 80%
ist Kollagen Typ II die häufigste Kollagenspezies im Knorpel (Miller und Matukas., 1969).
Die a1(II)-Kette hat eine große Sequenzhomologie zur a1(I)-Kette (Petit et al., 1992, Stark et al. 1972). Die a 1(II)-Kette zeigt aufgrund ihres höheren Gehaltes an Hydroxylysin eine stärkere Glykosierung (Miller, 1976). Kollagen II kommt außer im Knorpel auch noch im Glaskörper und während der Embryonalentwicklung in verschiedenen anderen Geweben
vor. Das COL2Al-Gen entspricht Prokollagen II und ist durch 50 Exone kodiert, von denen über 40 Exone zur tripelhelikalen Domäne gehören.
Exon 2 kodiert eine Cystein-reiche Domäne aus 69 Aminosäuren, die dem N-terminalen Propeptid in der Pro a1(l), der Proa1(III) und der Pro a2( V)-Kette entspricht. Das Kollagen IIA hat diese Domäne, während sie in der Kollagen IIB-Form fehlt. Prokollagen IIA findet sich bei der Embryonalentwicklung in den Knorpelvorläuferzellen, die fibroblastenähnlich aussehen (Sandeil et al., 1991; Nah und Upholt 1991). Diese Umwandlung von Kollagen II könnte eine Rolle bei der Embryonalentwicklung spielen. Außerdem wird vermutet, daß das Nterminale Propeptid des Kollagen II eine Feedback-Hemmung auf die Kollagensynthese ausübt (Fouser et al., 1991)

ii) Kollagen IX
Im Gegensatz zu Kollagen II bildet Kollagen IX ein Heterotrimer der Zusammensetzung a1(IX), a1(IX), a3(IX). Es ist der Prototyp der FACIT- Kollagengruppe und setzt sich aus drei tripelhelikalen Domänen und vier nicht-tripelhelikalen Domänen, die als COLDomänen, bzw. NC-Domänen bezeichnet werden, zusammen. Durch Pepsinbehandlung werden die NC-Domänen verdaut, so daß Kollagen IX in zwei Untereinheiten, LMW (low molecular weight) und HMW (high molecular weight) zerfällt. Die Polypeptid ketten der Untereinheiten verbinden sich durch Disulfidbrücken. Außer der NC4-Domäne der a1- Kette mit 243 Aminosäuren sind die anderen NC-Domänen sehr kurz (12-23 Aminosäuren).
Die NC3 Domäne der a2(IX) Kette weist 5 zusätzliche Aminosäuren auf, die eine Bindungsstelle für eine Glykosaminoglykankette enthalten. Während die COL3 Domäne von den Fibrillenoberfläche herausragt, sind COL1 und COL2 in den Fibrillenkörper
integriert. Die NC4-Domäne fehlt im Notochord (Hayashi et al. 1992), dem Glaskörper (Yada et al., 1990) und der Cornea (Svoboda et al. 1988), weil in diesen Organen ein
alternativer Promotor des al(IX)-Gens verwendet wird (Svoboda et al., 1988 und Nishimura et al., 1989). Die Lysinreste in der COL2-Domänc gehen eine kovalente Quervernetzung mit dem N-Telopeptid des Kollagens II ein. (Apone et al., 1988;Von der Rest und Mayne, 1988).
Kollagen IX-Moleküle weisen ausserdem untereinander Quervernetzung auf (Wu et al., 1992). Die anionische NC4-Domäne und Glykosaminoglykane sind in der Lage, Wechselwirkungen mit anderen Matrixmolekülen einzugehen. Deswegen ist denkbar, daß
Kollagen IX die Wechselwirkung zwischen Fibrillen und anderen Matrixmolekülen vermittelt. Kollagen IX bindet an die Oberfläche der Fibrillen. Deswegen wird vermutet,
daß Kollagen IX die Fibrillenabstände von Knorpelfibrillen reguliert. Kollagen IX wird als reifes Molekül sezerniert und unterliegt keiner weiteren Prozessierung im extrazellulären Raum.

iii) Kollagen X
Kollagen X weist keine oder nur eine geringfügige extrazelluläre Prozessierung auf und liegt als Homotrimer al(X) vor. Das Molekulargewicht der al-Kette von 59 kDa wird durch
limitierte Pepsin-Behandlung auf 48 kDa reduziert.
Kollagen X dient als ein Indikator für das späte Stadium der Chondrozytendifferenzierung.
Als erste haben Schmid und Conrad 1982 festgestellt, daß sich Kollagen X beim Vogel nur in hypertrophen Knorpel-Bereichen findet. Die weiteren Untersuchungen haben diese Hypothese bestätigt (Oshima et al., 1989; Liama et al., 1991; Linsenmayer et al., 1991; Kirsch und Von der Mark, 1991).
Einzige Ausnahme ist die Existenz von Kollagen X in der Eierschale. Bei der Rachitis nimmt die Kalzifizierung der Wachstumsfuge ab und die hypertrophe Zone wird breiter. Deswegen erwartet man mehr Kollagen X.
Aber Forschungsergebnisse weisen darauf hin, daß sich die Produktion von Kollagen X reduziert, weil die Konzentration von Serumkalzium abnimmt. In artikularem Knorpel findet sich
normalerweise kein Kollagen X. Von der Mark et al.1992 haben allerdings festgestellt, daß Kollagen X bei Osteoarthritis des Gelenkknorpels in oberen und mittleren Zonen von artikularem Knorpel zu finden ist.

A) Kollagen X Struktur
Das Kollagen X-Molekül besteht aus drei Domänen: einer kleinen nichthelikalen NTerminalen Domäne, einer helikalen Domäne und einer langen nichthelikalen CTerminalen Domäne. Der helikale Bereich enthält 460 Aminosäuren beim Vogel und 463 Aminosäuren beim Rind und beim Menschen. Im helikalen Bereich gibt es einige Imperfektionen
der (Gly-X-Y)n-Sequenz. An drei Stellen kommt anstatt der Gly-X-Y eine Sequenz von Gly-X-Y-Z-A vor, wo ein proteolytischer Angriff ermöglicht wird. (Welgus et al., 1990 ). Andere Imperfektionen des helikalen Bereichs von Kollagen X sind das Auftreten von Gly-X-Gly. Diese Imperfektion kommt nicht im Kollagen X des Huhnes vor.
Hier wird jedoch an der Stelle 1994 und 1997 der Aminosäurereste Glycin durch Cystein ersetzt (Kirsch und Von der Mark 1990; Thomas et al., 1991). Disulfidbrücken zwischen
helikalen Bereichen von Rinderkollagen X haben Yamaguchi et al., (1989) nach einiger Zeit in Zellkulturen festgestellt. Dieses fand man weiterhin auch bei Hund und Schaf. Bei Menschen, Kaninchen und Mäusen haben Marriott et al .,1991; Thomas et al., 1991; Apte et
al., 1992 kein Cystein im helikalen Bereich gefunden. An zwei Stellen des menschlichen Proteins wird eine X-Position des Gly-X-Y Triplets durch Glycin ersetzt, was wiederum beim Rind und Huhn nicht zu finden ist. Die C-terminale Domäne des menschlichen Kollagen X enthält 161 Aminosäuren und ist zu 89% der des Rindes und zu 77.7% mit des Huhnes identisch.
Die C-terminale Domäne enthält 13 Tyrosinreste, ungepaarte Cysteinreste und vermutlich Oligosaccharide. Es wird vermutet, daß die N-terminale Domäne nicht durch Proteasen abgespalten wird (Schmid und Linsenmayer., 1989 ).
Die helikale Domäne ist 138nm lang und zerfällt nicht durch Pepsin- und Chymotrypsinbehandlungen bei Raumtemperatur. Pepsin und Chymotrypsin spalten aber die globulären Teile des Kollagen X.

B) Suprastrukturelle Assoziation von Kollagen X
Nach der Doppelmarkierung von Kollagen X in Gewebe und in Zellkultur hat man festgestellt, daß Kollagen X in zwei suprastrukturellen Formen vorliegt. In der Nähe von Zellmembranen (perizellulärer Raum) findet sich Kollagen X als feines Filament und im interterritorialen Raum in Heterofibrillen zusammen mit Kollagen II (Schmid und Linsenmayer, 1991; Chen et al., 1990). Diese letztere Organisationsform ist jedoch nicht unbestritten (Disseration Hagg, 1997). Kollagen X hat Potential, sich zusammen zu binden und ein hexagonales Netzwerk zu bilden. Rekonstitutionsexperimenten (Rotary Schadowing) und Markierung von Kollagen X-Aggregaten liefern einige Beweise, daß erstens C-terminal-globulare Domänen sehr wichtig für multimere Formen von Kollagen X sind und zweitens helikale Domänen sich parallel oder antiparallel assoziieren.Die Kollagen X-Moleküle aggregieren vermutlich am C-Terminus und bilden durch ihre nichtkovalenten Interaktionen eine hexogonale Struktur (Schmid et al., 1990). Die Aggregate scheinen sich durch Bildung von hexogonalen Strukturen zu stabilisieren (Kwan et al., 1991).
Dieses Potential von Kollagen X sich zu aggregieren, ist vermutlich das Grunde für die Entstehung des feinen Filaments von Kollagen X in perizellulärem Raum. Neu synthetisiertes Kollagen X aggregiert mit schon existierenden Fibrillen im hypertrophen Breich (Oshima et al., 1989; Linsenmayer et al., 1991).
Diese Assoziation ermöglicht eventuell die Beteiligung von Fibrillen bei der Kalzifizierung (Schmid et al., 1990), die Degradation der Fibrillen (Welgus et al., 1990) und die Interaktion der Fibrillen mit Proteoglykanen (Chen et al., 1992).
Um diese Assoziation von Kollagen X mit Fibrillen zu stabilisieren, geht Kollagen X eine kovalente Bindung mit Fibrillen ein (Chen et al., 1992).

C) Degradation von Kollagen X
Diese Imperfektion von Kollagen X wird durch Kollagenase an zwei Stellen gespalten.
So entsteht drei Fragmente, ein 32-kDa Fragment, ein 18-kDa tyrosinreiches C-terminales Fragment und ein 9-kDa N-terminales Fragment (Schmid et al., 1986), von denen 32-kDa-Fragment bei Körpertemperatur für längere Zeit stabil ist. Schmid et al. haben 1986 festgestellt, daß Kollagen X durch Kollagenase leichter als Kollagen II angegriffen wird.
Kollagen X wird durch verschiedene Proteasen wie Elastase (Gadher et al., 1988), die 72- kDa Gelatinase/Typ IV Kollagenase (MMP2) (Welgus et al., 1990), Stromelysin (MMP3) (J. Wu et al.,1991), die 92-kDa Gelatinase und die Metallproteinase (H. Welgus et al., 1993) abgebaut.
Ein Gemisch von Kollagenase und Interleukin l bewirkt die Degeradation des 32- kDa Fragmentes von Kollagen X (Gadher et al.,1990).
Kollagen X ist gegenüber verschiedenen Kollagenasen unterschiedlich empfindlich. Es wird von der Kollagenase des Uterus 500 mal schneller als von der Hautkollagenase gespalten. Ein Terminus des Kollagen X wird schneller als der andere gespalten (Welgus et al., 1990). Die leichtere Spaltung des Kollagens X, die Spaltung von Kollagen X durch verschiedene Protease und Anwesenheit von Kollagen X auf Heterofibrillen-Oberfläche weisen daraufhin, daß Kollagen X vielleicht eine Rolle bei der Degeradation der Matrix spielt.

D) Die Rolle des Kollagens X auf Kalzifizierung des Knorpels
Das Auftreten von Kollagen X vor der Mineralisation und nur in der hypertrophen Zone läßt vermuten, daß Kollagen X eine Rolle bei der Kalzifizierung spielt. Die experimentellen Ergebnisse führen jedoch zu kontroversen Schlüssen. Kollagen X befindet sich in der Mineralisationszone (Schmid et al., 1990; Gibson et al., 1990). Kirsch und Von der Mark haben 1991 die Bindung von Kalzium an Kollagen X mit Kd von 32 mM gezeigt. Kollagen X bindet an der Oberfläche von Matrixvesikeln (Habuchi et al., 1985). Wu et al. haben 1991 diese Hypothese bestätigt und darüber hinaus gefunden, daß die Bestandteile der Matrixvesikel Annexin VT, Annexin V (Annexin V kontrolliert die Calcium/Phosphat Transport im Matrixvesikel, Berendes et al.,1993) und alkalische Phosphatase an Kollagen
X gebunden werden. Die Zunahme der Kollagen X-Synthese in Zellkulturen während der Inkubation mit organischen Phosphaten (z.B. ß-Glycerophosphat) und Kalziumchlorid weist daraufhin, daß die Verstärkung der Kalzifizierung die Erhöhung der Kollagen XSynthese fördert (Thomas et al., 1990).
Andere Untersuchungen haben jedoch gezeigt, daß Kollagen X die Mineralisation verhindert.
Poole und Pidoux haben 1989 nach ultrastrukturellen Untersuchungen und Doppelmarkierung Kollagen X im perizellulären Bereich von Chondrozyten nachgewiesen. Sie fanden aber keine Mineralisation in diesem Bereich. Im inneren Bereich der Eierschale gibt es Kollagen X.
Dieser Bereich ist aber nicht kalzifiziert (Arias et al., 1991). Aufgrund unserer Untersuchungen gehen wir davon aus, daß Kollagen X nicht alleine sondern nur in der Zusammenspiel mit anderen Faktoren (z.B. alkalische Phosphatase) eine Rolle bei der Mineralisation haben konnte.

E) Einfluß von Faktoren und Hormonen auf die Kollagen X-Synthese
Gibson et al. haben 1982 festgestellt, daß der molekulare Zustand und die Art der Kultur einen Einfluß auf die Kollagen X-Synthese haben. Sie fanden weiterhin, daß ein Gemisch von Kollagen I und II in der Zellkultur die Kollagen X-Synthese stimuliert.
Auch Vitamin D, Vitamin C, ß-Glycerolphosphat und Calzium stimulieren die Kollagen X-Synthese (Oettinger and Pacifici 1990).

iv) Kollagen Typ XI
Kollagen XI wird der Gruppe der fibrillenbildenden Kollagene zugeordnet. Somit hat das Molekül eine große tripelhelikale Domäne ohne Unterbrechungen der GXY-Sequenz, die eine Länge von 300 nm hat. Das Protein kommt außer im Knorpel in vielen anderen Organen und Geweben vor (z B. Knochen, Glaskörper), besitzt dann jedoch eine andere Polypeptidzusammensetzung. Im Knorpel ist Kollagen XI ein Heterotrimer der Zusammensetzung al(XI), a2(XI) und a3(XI). Die a3(XI)-Kette leitet sich von demselben Gen ab, wie die al(II)-Kette, ist jedoch anderen posttranslationelen Modifikationen unterworfen (Die a3(XI)-Kette ist vermutlich eine stärker glykosylierte Form der a1(II)-Kette (Burgeson und Hollister, 1979) ). Die al(XI)- und die a2(XI)-Kette besitzen jeweils große Ähnlichkeit mit den entsprechenden Ketten des Kollagens V, was nicht nur zu häufigen
immunochemischer Kreuzreaktion der Kollagen V- und Kollagen XI-Ketten führt, sondernauch zu „hybriden” Kollagen V / Kollagen XI Heterotrimeren im Glaskörper [al(XI)]2 a2(V) oder im Knochen [al(XI)]2 a2(V) oder a1(XI) a1(V) a2(XI) (Wu und Eyre, 1991).
Die heterotypischen Kollagenmoleküle weisen unterschiedliche Stöchiometrien auf (Eyre and Wu., 1987; Niyibizi and Eyre 1989, Mayne et al., 1993).
Kollagen XI befindet sich im Innern der Fibrillen und könnte als Nukleationskern für die Fibrillenbildung dienen (Eikenberry et al., 1992).

1.3.1.4 Fibrillen und Fibrillenbildung

Unter allen Proteinkonformationen erlaubt die Kollagentripclhelix den höchsten Grad an Interaktionen zwischen zwei benachbarten Molekülen. Zwei Drittel aller Aminosäure- Resten liegen auf der Moleküloberfläche.
Die naheliegendste Interaktion ist somit die laterale Aggregation mit anderen Tripelhelices (van der Rest, 1990). Die Kollagentripelhelix besitzt aufgrund der Verteilung ihrer hydrophilen und hydrophoben Sequenzbereiche ein charakteristisches Ladungsmuster.
Elektrostatische Anziehung und hydrophobe Wechselwirkungen regulieren die Zusammenlagerung der Moleküle zu pentameren Mikrofibrillen. Wie Abbildung 1.9 schematisch zeigt, sind die 300 um langen Moleküle um ca. ¼ ihrer Länge gegeneinander verschoben. Diese axiale Anordnung wird als „quarter stagger model” bezeichnet. Sie ist die Ursache des typischen Bandenmusters, das man bei elektronenmikroskopischen Aufnahmen von Kollagenfibrillen nach Kontrastierung mit schweren Metallatomen beobachten kann. Das Bandenmuster zeigt eine Periode von 67 nm, die eine d-Bande und mehrere a-, b-, c- und e-Banden enthält. Eine dichter gepackte Zone (overlap zone) wechselt mit einer lockeren gepackten Zone (gap zone) ab (Kühn, 1987).

i) Das Modell der Knorpelfibrille
Die Fibrillen aus embryonalem Hühnerbrustbeinknorpel haben einen konstanten Durchmesser von 17 nm. Erst glaubte man, daß sie aus dem knorpelspezifischen Kollagen II aufgebaut sind und aufgrund ihrer versetzten Anordnung eine longitudinale Periodizität von 67 nm zeigen (Eikenberry et al., 1984). Kürzlich konnte jedoch gezeigt werden, daß isolierte und gereinigte Fibrillen nach Pepsin-Verdau die Kollagentypen II, IX und XI in einem molaren Verhältnis von 8:1:1 enthalten (Vaughan et al., 1988). Rotationsbedampfung der Fibrillen ergab eine d-periodische Verteilung von 35 – 40 nm langen Fortsätzen, die an ihren Enden eine globuläre Domäne tragen. Mit monoklonalen Antikörpern gegen Kollagen IX
konnten diese Fortsätze als Typ IX-Kollagen identifiziert werden (Vaughan et al., 1988).
Auch die beobachtete kovalente Quervernetzung von Kollagen II und IX (van der Rest, 1988) legt nahe, daß sie Komponenten der gleichen Fibrille sind. Demzufolge ist Kollagen IX auf der Fibrillenoberfläche d-periodisch angeordnet, wobei seine Chondroitinsulfatkette in die Gap-Region zu liegen kommt und die COL 3- und NC 4-Domänen aus der Fibrille herausragen (Abb. 1.10).

Bei der extrazellulären Prozessierung von Prokollagen I wird erst das N-terminale Propeptid von der spezifischen N-Proteinase bgespalten. Es entsteht ein sogeanntes pCKollagen I, ein Prokollagen, das noch das C-terminale Propeptid enthält. Beim Prokollagen III wird zuerst das C-terminale Propeptid abgespalten und es resultiert das pN-Kollagen III.
Normalerweise werden die Kollagene vollständig prozessiert, und zylindrische Fibrillen können sich bilden. Bei gewissen erblichen Krankheiten ist jedoch die N-terminale Prozessierung defekt. Man beobachtet die Bildung von nicht-zylindrischen Fibrillen.
Solche Defekte können durch die reduzierte Aktivität der Proteinase, bei der Dermatosparaxis ist die pN-Peptidase genetisch defekt, oder durch Mutationen im Spaltungsbereich der Propeptide, beim Ehlers-Danlos-Syndrom Typ VIIB ist die a2(I)-Kette genetisch verändert, entstehen.
Huhnes et al. (1989) untersuchten die in vitro-Fibrillenbildung von pN-Kollagen I und fanden dünne, blattartige Strukturen, die zwar in Längsrichtung d-Periodizität zeigten, jedoch bis zu einigen mm breit sein konnten. Die Dicke entsprach bei allen Strukturen etwa 8 nm.
Mischungen von Kollagen I und pN-Kollagen führten zu einer Reihe pleomorpher Fibrillen.
Auch Mould et al. (1990) fanden, daß Prokollagen I in genügend hoher Konzentration verschiedene Aggregate formen kann, wie z.B. d-periodische Bänder mit einer Dicke von etwa 8 nm und Breiten bis zu l mm. Durch immunohistorische Methoden konnten sie die Propeptide auf der Oberfläche dieser Staikturen lokalisieren. Wir vermuten, daß Prokollagene demzufolge die Bildung d-periodischer Anordnungen hemmen, aber verhindern sie nicht.
Die Amiantoidfibrillen, die im Trichterbrustknorpel auftreten, sind dünn und breit (Rupprecht et al.,1988). Deswegen vermuten wir, daß pN-Kollagen II, das sich nicht durch mangelhafte Prozessierung zu Kollagen II umsetzt, in solchen Fibrillen eingebaut ist.

iii) Regulation der Fibrillenbildung in vivo
Für die Regulation der Fibrillenbildung in vivo wurden verschiedene Mechanismen
vorgeschlagen:

1) Interaktion mit Proteoglykanen
2) Sequenz und Ausmaß der Prokollagen-Prozessierung
3) Interaktion von verschiedenen Kollagentypen.

Vogel et al. (1984) haben gezeigt, daß PG-S2 aus Sehnen an Kollagen I und II bindet und die Fibrillenbildung in vitro hemmt. Für das PG-S2 aus Knorpel konnte jedoch keine vergleichbare Hemmung festgestellt werden.
Hedbom und Heinegard (1989) zeigten mittels Trübungsmessungen, daß Fibromodulin aus bovinem Gelenkknorpel die Fibrillenbildung von nativen wie auch Pepsin-verdauten Kollagenen I und II hemmt. Fibromodulin interagiert demzufolge mit dem tripelhelikalen Bereich der Kollagene. Auch stellen sie eine größere Hemmung fest, wenn Fibromodulin und PG-S2 gleichzeitig den Kollagenen zugesetzt werden. Es scheint, daß die beiden Proteine eine synergistische Wirkung auf die Fibrillenbildung ausüben. Die veränderten optischen Daten in Anwesenheit von Fibromodulin weisen zudem auf die Bildung von strukturell verschiedenen Fibrillen hin.
Wir vermuten, daß der Existenz von Prokollagen formen zur Hypothese führten, daß die umfangreichen, größtenteils globulären Propeptide intrazellulär die Bildung von intakten Fibrillen verhindern und somit gut transportierbare Formen darstellen. Außerdem würden Prokollagene sich aber in der extrazellulären Matrix an wachsende Fibrillen anlagern, die Oberfläche blockieren und dadurch den Durchmesser der Fibrillen kontrollieren können.
Die Reihenfolge und die Kinetik der N- und C-terminalen Propeptid-Abspaltung durch die in der Matrix lokalisierten Proteinasen haben Einfluß auf die Fibrillenbildung in vivo (Kühn, 1987).
Die Interaktion zwischen verschiedenen Kollagentypen fuhren zur Regulation des Durchmessers der Fibrillen. Birk et al. (1990) konnten zeigen, daß die Interaktion von Kollagen I und V den Fibrillendurchmesser in vitro regu liert. Gereinigtes Kollagen V bildet in vitro dünne Fibrillen ohne erkennbare Periodizität. Breite Typ I-Fibrillen zeigen nebst ausgeprägtem Bandenmuster eine Streuung des Durchmessers. Pepsin-verdautes Kollagen V zeigt deutlich weniger Einfluß auf den Fibrillendurchmesser. Die N-terminale globuläre Domäne ist demnach für den regulatorischen Effekt essentiell.

1.3.2 Proteoglykane

Proteoglykane (PG) bilden nach den Kollagenen die zweithäufigste Komponente des Knorpelgewebes. Proteoglykane sind Glykoproteine, deren Polypeptidkette (Proteincore) mit einer oder mehreren Glykosaminoglykanketten kovalent verknüpft ist (Kjellén und Lindahl, 1991). Glykosaminoglykane (GAG) sind unverzweigte anionische Polysaccharidketten, die aus Disaccharideinheiten zusammengesetzt sind.
Man unterscheidet vier Hauptgruppen von GAG-Ketten:

1. Hyaluronsäure,
2. Chondroitinsulfat und Dermatansulfat,
3. Heparansulfat und Heparin
4. Keratansulfat.

Hyaluronsäure stellt in dieser Gruppe eine Ausnahme dar, weil es nicht sulfatiert ist und keine kovalente Verknüpfung mit einem Proteincore aufweist (Prehm, 1983). Proteoglykane, die mit Chondroitinsulfat-, Dermatansulfat- und Keratansulfatketten substituiert sind, haben vor allem strukturelle Bedeutung als Matrixproteoglykane (Fosang und Hardingham, 1996), und die mit Heparansulfatketten substituierten Proteoglykane erfüllen in der Regel eine Funktion als Co-
Rezeptoren auf der Plasmamembran der Zellen (Gallagher, 1996).

1.3.2.1 Hyaluronsäure bindende Moleküle

Der interfibrilläre Raum im Knorpel ist angefüllt mit großen Proteoglykanaggregaten, die durch die Bindung von Aggrecan an Hyaluronsäure entstehen.
Aggrecan ist das am häufigsten vorkommende Proteoglykan in der Knorpelmatrix.
Es besitzt ein roteinzentralfilament von etwa 210 kDa mit verschiedenen Domänen (Heinegard and Oldberg, 1993).

Im mittleren Teil seiner Polypeptidkette trägt das reife Proteoglykanmonomcr etwa 30 Keratansulfat- Glycosaminoglykanketten und ungefähr 100 Chondroitinsulfatketten
(Heinegard and Axelsson, 1977; Doege et al., 1987).
Das komplette Molekül erreicht eine molare Masse von über 3×106 Da. Außerdem weist das Zentralfilament noch N- und Overknüpfte Oligosaccharide auf.
Das Protein enthält zwei homologe globuläre Domänen (G1 und G2) im N-terminalen Teil der Peptidkette, sowie eine weitere globuläre Domäne (G3) im C-terminalcn Teil. (Paulsson et al., 1987). Die Gl-Domäne zeigt eine spezifische
Bindung an Hyaluronsäure (Heinegard and Hascall, 1974).
Die Funktionen der G2- und G3-Domäne sind nicht geklärt. Die Domänenstruktur des Aggrecans wird in der unten folgenden Abbildung gezeigt (Abb. 1.11).
Die Bindung von Aggrecan an Hyaluronsäure wird durch das Link-Protein verstärkt (Heinegard and Hascall, 1974).
Dieses knorpelspezifische Protein setzt sich aus drei Polypeptiddomänen zusammen und weist eine hohe Homologie zur G1-Domäne des Aggrecans auf (Neame et al., 1986).
Entlang eines Hyaluronsäuremoleküls können sich bis zu 100 Aggrecanmoleküle anlagern und so große Aggregate mit einer molaren Masse von 300-400×106 Da bilden.
Als weiteres Proteoglycan dieser Gruppe wurde Versican in artikularem Knorpel nachgewiesen, das allerdings in wesentlich geringerem Maße exprimiert wird als Aggrecan (Grover und Roughley, 1993).

1.3.2.2 Glykoproteine mit leuzin-reichen Motiven

Gemeinsames Merkmal dieser Proteinfamilie, die derzeit neun Mitglieder umfaßt, ist ein leuzin-reiches Strukturmotiv (Patthy, 1987), das in einer großen Anzahl unterschiedlichster Proteine gefunden wurde (Kobe und Deisenhofer, 1994). Die leuzin-reichen Motive (LRR: leuzine-rich repeat) haben eine Länge zwischen 20 und 29 Aminosäuren und weisen in dieser Sequenz mehrere konservierte Leuzinreste auf. Die größte Gruppe innerhalb der Proteinfamilie mit leuzin-reichen Motiven bilden die kleinen leuzin-reichen Proteoglykane (SLRP: small leucine-rich repeat proteins). Ausgehend von einem Vergleich der Sequenzen unterscheidet man drei Untergruppen innerhalb der Gruppe der SLRP (lozzo, 1997).
Die erste Untergruppe bilden Decorin (Krusius und Ruoslahti, 1986) und Biglycan (Fisher et al., 1989), deren Polypeptidketten zu 55% homolog sind. Beide Proteine besitzen im Nterminalen Bereich Substitutionsstellen für Glykosaminoglykanketten und haben eine zentrale Domäne mit leuzin-reichen Domänen. In den N- und C-terminalen Polypeptidsequenzen befinden sich Cysteinreste, die durch Disulfidbrücken verknüpft sind (Neame et al., 1989).
Beim Decorin ist ein Serinrest mit einer CS/DS-Kette glycosyliert, bei Biglycan sind hingegen zwei Serinreste substituiert.
Abhängig von der Epimerisierung handelt es sich bei der GAG-Kette entweder um eine Chondroitinsulfat- (mit DGlucuronsäure als Disaccharidkomponente) oder um eine Dermatansulfatkette (mit LIduronsäure).
Im Knorpel des Huhns wurde Biglykan nicht nachgewiesen. Allerdings kommt Decorin im Huhn offenbar in einer Ein- und Zweikettenform vor (Blaschke et al., 1996). Für Decorin ist in einigen Fällen eine Fibrillenbindung beschrieben worden (Pringle and Scott, 1990). Durch die Wechselwirkung mit Decorin wird in vitro die Fibrillenbildung
verzögert, und es werden dünnere Fibrillen gebildet (Vogel, 1984; Vogel und Trotter, 1987).
Weiterhin ist für den transformierenden Wachstumsfaktor-ß (TGF-ß: Transforming Growth Factor-ß) eine Bindung an Decorin beschrieben, und es wird angenommen, daß Decorin für diesen Wachstumsfaktor als Speicher in der extrazellulären Matrix dient (Yamaguchi et al., 1990).
Die zweite Untergruppe der kleinen leuzin-reichen Proteoglykane bilden Fibromodulin, Lumican, Keratocan und PRELP. Fibromodulin (Oldberg et al., 1989) und Lumican (Blochberger et al., 1992) sind Keratansulfatproteoglycane, die im N-terminalen Bereich des Proteins sulfatierte Tyrosinreste aufweisen und im mittleren Teil ihrer Polypeptidkette mit einer oder mehreren Keratansulfatketten substituiert sind.
Die Polypeptidketten der beiden Proteine zeigen eine zu 48% homologe Sequenz.
Für Fibromodulin wurde eine Wechselwirkung mit Fibrillen nachgewiesen, und zwar an den Positionen, die nicht von Decorin gebunden werden (Hedbom und Heinegard, 1993).
Dies ist möglicherweise ein Hinweis auf eine reziproke Funktion von Fibromodulin und Decorin.
Die zwei weiteren Proteoglykane dieser Gruppe, Keratocan und PRELP, zeigen eine 55%ige Sequenzhomologie. Keratocan besitzt ein Molekulargewicht von 38 kDa und sein
Proteincore ist mit bis zu drei Keratansulfatketten substituiert (Corpuz et al., 1996; Dunlevy et al, 1998).
Die cDNA von PRELP (proline-arginine-rich and leucin-rich repeat protein) wurde aus artikularem Knorpel kloniert (Bengtsson et al, 1995).
Besonderes Merkmal der Sequenz ist die Prolin- und Arginin-reiche N-terminale Domäne.
Im zentralen Teil der Polypeptidkette befinden sich drei mögliche Substitutionsstellen für Keratansulfatketten.
Die dritte Untergruppe besteht aus den Proteoglycanen Epiphycan, einem Dermatansulfatproteoglykan, das ursprünglich im Gliedmaßenknorpel embryonaler Hühner gefunden wurde (Shinomura und Kimata, 1992), und Osteoglycin, das in der Cornea vom Rind als Keratansulfatproteoglykan vorkommt (Funderburgh et al, 1997).
Als weiteres Glycoprotein mit leuzin-reichen Motiven kann hier noch das Chondroadherin (Neame et al, 1994) erwähnt werden.
Chondrozyten zeigen eine Adhäsion an Oberflächen, die mit diesem 36 kDa Protein beschichtet waren (Sommarin et al, 1989).
Mittlerweile wurde das Integrin a2ßl als Rezeptor für Chondroadherin identifiziert (Camper et al, 1997).

1.5 Transport und Funktion von Zinkionen

Bei unserer Arbeit haben wir eine mangelhafte Funktion von N-Prokollagen-Protease festgestellt, welche entweder auf die Zinkverarmung in Chondrozyten oder mangelhafte
Bindung von Zink an N-Prokollagen-Protease zurückgeführt werden könnte.
Zinkionen erfüllen in den Zellen verschiedene Funktionen. Sie sind Bestandteil und Cofaktor von mehr als 300 Enzymen (darunter die MMPs und die N- Prokollagen-Proteasen), wirken als Stabilisator biologischer Membranen und sind Bestandteil DNA-bindender Proteine (z. B.
Steroidrezeptoren).
Die Aufnahme von Zink in den Organismus erfolgt in Jejunum und Ileum. Im Blut wird das Zink dann an Plasmaproteine gebunden (besonders an Albumin), transportiert und zur
Aufnahme in die Gewebe wieder freigesetzt. Der Plasmazinkspiegel beträgt normalerweise 100-400 mg/100 ml (15-20 mmol/l). Der Mechanismus des Transports der Zinkionen in der
extrazellulären Matrix und durch die Zellmembran hindurch ist bisher noch nicht genau geklärt. Durch den Einsatz von radioaktivem Zink (65Zn) versucht man darüber Aufschluß
zu erhalten. Dabei hat man über den Transport in Enterozyten, Hepatozyten und Erythrozyten nur begrenzte Informationen gewinnen können. Die meisten Experimente
konzentrieren sich dabei auf den Transport von Zinkionen in Enterozyten. Die Kinetik des Transports von Zinkionen in diese Zellen gibt Hinweise auf eine schnelle Sättigung der
Zellen mit Zink (Ostreicher & Cousins, 1989). Die schnelle Sättigung der Enterozyten mit Zink ist wahrscheinlich auf die Assoziation der Zinkionen mit spezifischen
Transportproteinen in der Zellmembran zurückzuführen (Blakeborough & Salter, 1987).
Während Cadmiumionen den Transport von Zinkioncn in Enterozyten hemmen (Blakeborough & Salter, 1987; Tacnet et al., 1990), wird die Aufnahme in Erythrozyten durch Anionen wie Bicarbonat erleichtert (Kalfakakou & Simons, 1990).
Der Nachteil des Einsatzes von radioaktivem Zink (65Zn) ist jedoch, daß man bei der folgenden Radioaktivitätsbestimmung nicht unterscheiden kann, ob die Zellen die Zinkionen aufgenommen
haben, oder ob sie lediglich an die Zellmembran gebunden wurden. Eine Alternative zu dieser Methode ist der Nachweis von intrazellulärem Zink durch Zinquin (TSQ und (2- methyl-8-p-toluenesulfonamid-6-quinolyloxy) acetic acid), das an Zinkioncn bindet und damit einen fluoreszierenden Farbstoff bildet. Einen Nachteil bei diesem Verfahren stellt die
minimale meßbare Konzentration an freien Zinkionen dar, die im nanomolaren Bereich liegt. Die erwartete intrazelluläre Konzentration an freien Zinkionen liegt jedoch im pikomolaren Bereich. Außerdem ist noch nicht bekannt, ob und wie stark dieser Farbstoff an in der Zelle gebundenes Zink bindet.

1.6 Trichterbrust

Die Trichterbrust (Pectus excavatum) ist eine endogene Heinmungsmißbildung mit
bogenförmiger Einziehung des kaudalen Teils des Bmstbeins oder des Schwertfortsatzes im
Brustraum zwischen dem Centrum tendineum des Zwerchfells und der Thoraxvorderwand.
Die Kielbrust (Pectus carinantum) gehört zur gleichen Krankheitsgruppe (Robischek et al.,
1979).

Die Trichterbrust ist mit 90% die häufigste angeborene Deformität der Brust. Die Angaben
zur Inzidenz schwanken zwischen 0,03-3,5%. Erlangen, ein Zentrum für die Trichterbrustkorrektur, gibt die Inzidenz mit 0,85% an. Der männliche Bevölkerungsanteil ist 2-3mal häufiger als der weibliche betroffen.
In der Landbevölkerung kommt die Trichterbrust dreimal häufiger vor als in der Stadtbevölkerung (Krug, 1983; von der Oelsnitz, 1983).Ohne
es genauer bestimmen zu können, haben genetische Faktoren offensichtlich einen Einfluß.
Hinweise dafür bieten familiäre Häufung und die vermehrte Kombination mit Fehlbildungen der Wirbelsäule und/oder anderen Anomalien, wie z. B. Vituium cordis, Mitralklappenanomalien, Pulmonalagenesie, Hüftdysplasie, Hüftluxation, Schädelmißbildungen, Marfan-, Turner- und Pierre-Robin-Syndrom, Epilepsie (Von der Oelsnitz, 1983; Meister, 1982).

1.6.1 Klinik

Es werden klinisch gesehen vier Trichterbrust-Typen unterschieden (Hummer, 1985; Raithel et al., 1983; Willital, 1981):

a) symmetrisch-normal gewölbter Thorax:
Der Trichter umfaßt nur die unmittelbar sternalen Abschnitte des Brustkorbs b) asymmetrisch-axiale Torsion des Coipus sterni bei sonst normal gebautem Thorax:
Die Trichterwände sind unterschiedlich steil.
c) symmetrischer Platythorax:
Der sternovertebrale Abstand ist nicht nur im Trichter sondern im ganzn Sternumverlauf vermindert.
d) asymmetrischer Platythorax
Die Verkleinerung des intrathorakalen Raums führt zur Beeinträchtigung der mediastinalen Organe und zu einer signifikanten Häufung kardiopulmonaler Funktionsstörungen [Willital et Bürger, 1975].
Im EKG finden sich: Rechtsablenkung der elektrischen Herzachse, Pdextrokardiale, negative T-Wellen in den Brustwandableitungen, Rechtsverspätung und Rhythmusstörungen (Leutschaft et Geyer, 1968).

1.6.2 Pathogenese

Es existieren viele Hypothesen zur Pathogenese der Trichterbrust. Keine von ihnen gibt aber eine befriedigende Erklärung zur ihrer Genese.
Brown (1939) führte die Entstehung einer Trichterbrust auf einen verkürzten mediastinalen Bandapparat zurück, der eine Zugwirkung auf das Sternum ausübt.
Maneke (1959) behauptete, daß eine sternokostale Dysplasie mit funktioneller Fibroblasteninsuffizienz die Ursache einer Trichterbrust sei.
Sternum und Rippenknorpel seien durch eine intrathorakale Sogwirkung deformiert worden.
Geisbe (1967) zeigte im Tierexperiment, daß die mechanische Schädigung des Brustbeins beim Kaninchen durch inspiratorisches Druckgefälle zur trichterartigen Einziehung der
vorderen Brustwand führt. Die von ihm festgestellten histologisch regressiven Veränderungen deutete er als Folge vermehrter mechanischer Belastung bzw. als vorzeitige
Knorpelalterung (Geisbe et al., 1967 und 1972).
Leutert und Tischer (1968) vertraten die Auffassung, daß degenerierte Knorpelzellen, demaskierte kollagene Fasern und die Anhäufung saurer Mukopolysacharide im deformierten Rippenknorpel einer Trichterbnist keine krankhaften Veränderungen sind sondern altersbedingte Vorgänge, die normalerweise erst 5 Jahre später zu beobachten sind.
Andere Autoren waren der Meinung, die Thoraxdeformität beruhe auf einem übermäßigen Rippenwachstum, so daß es zu einer Ein- oder Ausstülpung des Brustbeins komme (Robicsek et al., 1979; Stauffer, 1976).
Kresse und Mitarbeiter (1969) kamen aufgrund biochemischer Untersuchungen zu dem Ergebnis, daß bei einer Trichterbrust ein Stoffwechseldefekt des Chondroitinsulfats vorliege.
Spurenelementanalytische Untersuchungen eines Trichterbrustknorpel (Rupprccht et al., 1987) ergaben einen hoch signifikanten Zinkabfall bei gleichzeitig erhöhtem Magnesiumund Calciumgehalt gegenüber einem gesunden Kontrollkollektiv.
Elektronemnikroskopische Untersuchungen zeigten, daß es zu einem vermehrten Auftreten von degenerativ veränderten Chondrozyten kommt.
Die Kollagenfibrillen sind abschnittsweise irregulär strukturiert und ähneln z.T. Amianthoidfibrillen. Daneben findet sich auch “long-spacing collagen” (Rupprecht et al., 1987; Rupprecht, 1990).
Die Anordnung dieses Kollagens zeigt eine sehr große Ähnlichkeit mit elcktronemnikroskopischen Darstellungen von Typ VI Kollagen (Bruns, 1984; Bruns et al., 1986; Keene et al., 1988; Lütjen-Drecoll et al., 1989).

Die Spätdifferenzierung der humanen Chondrozyten im Rippenknorpel Rippenknorpel wurde bisher als Permanentknorpel ohne enchondrale Ossifikation angesehen. Neure Untersuchungen weisen jedoch daraufhin, daß kostaler Knorpel mit zunehmendem Alter ossifiziert (Koebke und Saternus, 1982 & 1985).
Deshalb ist eine Vorhersage, daß in Rippenknorpel auch Spätdifferenzierung des Knorpels stattfinden muß.
Diese Hypothese sollte in dieser Arbeit weiter verfolgt werden und die Ursache für die Ossifikation sollte besser analysiert werden.
Zinkmangel in Trichterbrustchondrozyten Rippenknorpel von Trichterbrustpatienten enthält Zink in geringeren Mengen als normaler kostaler Knorpel (Hinweis auf relevanten Einleitungsparagraphen).
Von dieser früheren Beobachtungen ausgehend, sollten der Zinkmangel in Trichterbrustchondrozyten durch quantitative Analyse bestätigt oder verworfen werden. Danach sollte ermittelt werden, Welche Ursache der verminderten Aufnahme von Zink in das Gewebe zu Grunde liegen und schließlich die biochemischen Konsequenten auf der kollagenstoffwechsel näher beobachtet werden.
Die Differenzierung der Osteoblasten-ähnlichen Zellen in dreidimensionaler Matrix Die Differenzierung und die Aufrechterhaltung des Phänotyps in der Kultur ist abhängig von Signalen der Umgebung. Diese Umgebung wirkt über zwei unterschiedliche Typen von Signalen (erstens über die Struktur der extrazellulären Matrix und zweitens über lösliche diffundierende Faktoren).
Die Rolle der dreidimensionalen Matrix bei der Differenzierung der aus Periost stammenden Osteoblasten-ähnlichen Zellen sollte in Suspensionskulturen näher erforscht werden.
Die Annahme, daß sich die Osteoblasten-ähnlichen Zellen in der dreidimensionalen Matrix anders als in der zweidimensionalen Matrix verhalten, verhilft uns zu der Idee, Osteoblastenähnlichen Zellen in der dreidimensionalen Matrix zu kultivieren. Die Signale, die von der extrazellulären Matrix in Osteoblasten-ähnlichen Zellen weitergegeben wurden, sollte einen Einfluß auf die phänotypische und biochemische Änderung der Zellen haben.
Ausgangspunkt war die Idee, die phänotypische und biochemische Änderung von Osteoblasten-ähnlichen Zellen in der adhärenten und nicht-adhärenten dreidimensionalen Matrix zu bestimmen.

3.1 Materialien

Lösungen und Reagenzien:

Allgemeine Reagenzien
                 Glycerol (ICN, Aurora, OH, USA)
                 Glycin Natriumlaurysulfat (SDS)
                 Tris
                 Dinatriumhydrogenphosphat Dihydrat (Roth, Karlsruhe, D)
                 Eisessig
                 Harnstoff
                 Methanol
                 Natriumchlorid
                 0,2% P-Nitrophenylphosphat (Sigma 104 Phosphatase Substrat)
                 Ammoniumacetat (Merck, Darmstadt, D)
                 Ethanol
                 Isopropanol
                 Natriumhydrogenkarbonat
                 Salzsäure, konz.
                 Diethanolamin (Sigma, Deisenhofen, D)
                 Freud'sches Adjuvans (kompl./nichtk.)

PMSF Lösungen und Reagenzien (Zellkultur):

Krebspuffer
                 15,7 mM Na2HPO4,
                 1,6 mM KH2PO4,
                 111,2 mM NaCl,
                 5,4 mM KC1,
                 1,3 mM MgC1
                 2,4 mM NaHCO3,
                 13 mM Glucose,
                 pH 7,4

PBS (Zellkultur)
                 140 mM NaCl,
                 8 mM Na2HPO4,
                 3 mM KC1,
                 1,5 mM KH2P04,
                 pH7,4
                 Dulbecco's modifiziertes Eagle Medium (Gibco Life Technologies,
                 Paisley, Schottland, Kat.-Nr.: 52100-013)
                 Kollagenase B aus Clostridium histolyticum, EC 3.4.24.3. (Boehringer Mannheim, D, Ka.-Nr.: 1088831)
                 hochschmelzende Agarose SEA KEM (FMC BioProducts Rockland, USA, Biozym, Hess. Oldendorf, D, Kat. Nr.: 50004)
                 niedrigschmelzende Agarose SEA USA, PLAQUE (FMC BioProducts Rockland, Biozym, Hess,

                 Oldendorf, D, Kat. Nr.: 50102) Penicillin,
                 Streptomycin (Gico Life Tehcnologies, Paisley, Schottland, Kat.-Nr.: 15140-114)
                 Fungizon: Amphotericin B 250 mg/ml (Gibco Life Technologies, Paisley, Schottland, Kat.- Nr.: 15290)
                 Fötales Kälberserum (PAA, Linz, A, Kat. Nr. : A 1 5-043)
                 14C-Prolin (NEN, Dreiech, D)
                 L-Cystein (Sigma, Deisenhofen, D)
                 Ascorbinsäure (Merck, Darmstadt, D)
                 ß-Aminopropionitril (Sigma, Deisenhofen, D)
                 Pyruvat (Fluka, Buchs, CH)
                 Insulin (bov. Pankreas) (Boehringer, Mannheim, D, Dat.-Nr.:977420)
                 IGF-I (Boehringer, Mannheim, D)
                 Storage-puffer 0,4 M NaCl, 100 mM Tris-HCL,
                 pH 7,4 Lösungen und Reagenzien (alkalische Phosphatase) 

Reaktionslösung
                 0,2% p-Nitrophenylphosphat in Diethanolamin- HCl,
                 pH 9,8
Stopplösung
                 2M NaOH,
                 0,2 mM EDTA

Lösungen und Reagenzien (Elektrophorese, Kollagenanalyse)
                 40% (w/v) Acrylamid/Bisacrylamid-Stammlösung Acrylamid/Bisacrylamid 37,5:1) (Appligene oncor, Illkirch, F)
                 Sammelgelpuffer (Stammlösung)
                 0,5 M Tris, 0,4% SDS, pH 6,8
                 Trenngelpuffer (Stammlösung)
                 1,5 M Tris, 0,4% SDS, pH 8,8
                 Kammerpuffer
                 25 mM Tris, 0,1% SDS, 0,2 M Glycin

SDS-Probenpuffer:
                 0,1 M Tris-HCl, pH 6,8 mit 10% (w/v) Glycerol, 2% (w/v) SDS, 0,8 M
                 Harnstoff, 0,001% (w/v) Bromphenolblau.
                 Der reduzierende0 Probenpuffer enthielt 5% (v/v)
                 ß-Mercaptoethanol.

Entfärblösung
                 10% Methanol, 10% Essigsäure Pepsin (procine)
                 Coomassie Blue R-250 (Serva, Boehringer Ingelheim Bioproducts Partnership, Heidelberg)
                 Coomassie Blue-Lösung 0,1% Coomassie in 25% 2-Propanol, 10% Essigsäure
                 Ammoniumperoxodisulfat
                 Molekulargewichtsstandard (6,4- 200 kDa) (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)
                 Plyklonaler Antiköper gegen Kollagen X des Huhns (Von der Mark, 1997)

Sekundärer Antikörper gegen Immunglobulin G des Kaninchens
gekoppelt mit Peroxidase (Kirgegaard & Perry Lab., WAK Chemie, Bad Homburg v.H.)
Chemoluminessenzsystem ECL (Amersham Life Science, Kat.-Nr.: 2106)
4-Chlor-l-Naphtol (Sigma, Deisenhofen, D)

Lösungen und Reagenzien (Elektronmikroskopie):

Fixierlösung
                 3% Paraformaldehyd,
                 0,4% Glutaraldehyd,
                 3,4% 0,1M Natriumcacodylat pH 7,4,
                 Osmium,
                 Propylenoxid

3.2 Methoden

3.2.1 Chondrozytenzellkultur

3.2.1.1 Die Isolierung von Chondrozyten aus Rippenknorpel

Der aus der Kinderchirurgie und des Rechtsmedizin erhaltene Rippcnknorpel wurde zweimal in Krebspuffer mit 100 U/ml Penicillin, 100 mg/ml Streptomycin und 2,5 mm/ml Fungizon gewaschen und von Perichondrium und Geweberesten befreit. Anschließend wurde er dreimal in Krebspuffer mit 10 U/ml Penicillin, 100 mg/ml Streptomycin und 2,5 mg/ml Fungizon gewaschen. Der gewaschene Rippenknorpel wurde quer zu seiner Längsachse ca. 0,3 mm dünn geschnitten. Der geschnittene Knorpel wurde über Nacht mit 2 mg/ml bakterieller Kollagenase in DM EM unter Zusatz von 100 U/ml Penicillin, 100 mg/ml Streptomycin und l mM Cystein im Brutschrank (37° C; 5% CO2) verdaut.

Um die Verdauung zu beschleunigen wurden die Zellen durch vorsichtiges Aufsaugen und Zurückpipettieren der Verdauungslösung suspendiert. Die Dauer des Verdauens durch die Kollagenase steigt mit dem Alter des Knorpels an. Nach der Verdauung wurde die entstandene Chondrozytensuspension durch einen 40mm Nylonfilter gegeben, um Gewebereste zurückzuhalten. Zur Vermeidung von Zellverlusten wurde die Petrischale und der Nylonfilter anschießend mit Krebspuffer gespült und die Zellsuspension auf 50 ml aufgefüllt. Sie wurde zentrifugiert ( 600 x g, 5 min, RT) und das Zellpellet erneut in 50 ml Krebspuffer resuspendiert. Insgesamt wurden die Zellen zweimal gewaschen.

Sie wurden schließlich in 10 ml Krebspuffer aufgenommen, die Zellzahl dieser Suspension wurde mit Hilfe einer Neubauer-Kammer im Phasenkontrastmikroskop bestimmt. Die Zellsuspension wurde zentrifugiert, und das Zellpellet wurde anschließend in DMEM so aufgenommen, daß die Zellzahl dieser Einzelzellsuspension auf 4×106 eingestellt wurde.
Diese Zellsuspension wurde weiter für die Agarosesuspensionskulturen verwendet.

3.2.1.2 Die Agarosesuspensionskulturen (Benya und Schaffer, 1982)

Sterile Petrischalen wurden mit einer 1% (w/v) hochschmelzendcn Agarose (in H2O) beschichtet (0,7 ml/ 35 mm Schale). Um die Agaroselösung zu sterilisieren, wurde sie autoklaviert. Dann wurden 700 ml der sterilen Agaroselösung auf dem Schalenboden verteilt. Diese Schicht ließ man bei Raumtemperatur gelieren. Zum Anlegen der Agarosesuspensionskultur wurde die Zellsupension im Verhältnis 1:1 zu einer Mischung aus gleichen Teilen zweifach konzentriertem DMEM und 2%-iger wäßriger Agarose gegeben.
Die Agaroselösung wurde autoklaviert und dann mit dem zweifach konzentrierten Medium gemischt. Zu dieser Mischung wurden die Zellsuspension, die auf die erforderliche Zelldichte eingestellt war, pipettiert. Die Schalen wurden 15 Minuten lang auf eine Wärmeplatte gestellt, um die Agarose vorläufig in flüssigem Zustand zu halten.
Dadurch sedimentieren die Chondrozyten auf die Grenzfläche der beiden Agaroseschichten. So wird die Beobachtung der Zellen im Phasenkontrastmikroskop und die Quantifizierung der Zellzahle ermöglicht. Nach erfolgter Sedimentation der Zellen wurde die flüssige Zell-Agarosemischung im Kühlschrank bei 4°C 10 Minuten lang verfestigt.

Nach dem Gelieren der Agarose wurden die Kulturen im Brutschrank (5% Kohlendioxid, 37° C) inkubiert. Das Kulturmedium wurde auf die Agarosesuspension pipettiert. Als Kulturmedium wurde DMEM verwandt, welches 60 mg/ml ß- Aminopropionitril, 25 mg/ml Ascorbat, l mM Cystein, l mM Pyruvat, 1% (v/v) Penicillin und 1% (v/v) Streptomycin enthielt. Je nach den experimentellen Bedingungen wurden Wachstumsfaktoren, fötales Kälberserum und/oder 15 mM Zinksulfat zugesetzt. Im Abstand von 3 Tagen wurde das Medium ersetzt.

3.2.1.3 Die Bestimmung der Zellvitalität mit Trypanblauausschuß

Für die Bestimmung vitaler Zellen haben wir 100 ml einer 0,5% Trypanblaulösung in PBS zum Kulturmedium pipettiert. Nachdem die Kultur für 20 Minuten im Brutschrank inkubiert worden war, wurde das Medium von der Kultur abgenommen, und die Zahl der Trypanblau negativen Zellen ermittelt.

3.2.1.4 Die Kollagenpräparation aus Knorpelzellkulturen

i) Markierung der Zellen
Die Kulturen wurden in der Regel von 15 Uhr bis 63 Uhr (für 48 Stunden) mit l mCi/ml L-[C14-U]-Prolin metabolisch markiert. Anschließend wurde entweder nur das abgenommene Medium oder die gesamte Kulturschale bei -20° C eingefroren.
ii) Isolierung der Kollagene aus der gesamten Kultur
a) Isolation der nativen Kollagene

Nach dem Auftauen der eingefrorenen Kultur wurde das abgenommene Medium in 2ml-Eppendorfgefäßen zentrifugiert (1000 x g, 15min), um die Agarose vom Medium zu trennen. Das Pellet wurde verworfen, und aus dem Überstand wurden die Kollagene bei einer Konzentration von 4,5 M NaCl ausgefällt. Man gab langsam festes NaCl bis zu einer Konzentration von 4,5 M zu, rührte für 6 Stunden und zentrifugierte (RPM 14000, F2402, 30min, 4° C, 17530g) die präzipitierten Kollagene ab. Der Überstand wurde verworfen. Das Pellet wurde in 300 ml Storage-Puffer (0,4 M NaCl, 0,1 M Tris-HCl, pH 7,4) aufgenommen. Die Kollagene wurden mit 1700 ml Ethanol präzipitiert, abzentrifugiert (F2402, 17530 x g, 20 min, 4° C) und in deionisiertes Wasser aufgenommen. Nach 2 mal wiederholter Ethanolpräzipitation wurden die Kollagene in 100 ml Probenpuffer aufgenommen.

b) Isolation der Pepsin-resistenten Kollagene

Nach dem Auftauen wurde die zellhaltige Niedertemparatur-Agarose von der Hochtemperatur-Agarose getrennt. Die Hochtemperatur-Agarose wurde verworfen. Die Niedcrtemperatur-Agarose wurde in Zentrifugenröhrchen (Beckman) überführt, mit dem Medium der Kulturschale vereinigt und für den limitierten Pepsinverdau mit 5ml einer Pepsinlösung (l mg/ml Pepsin in 0,5 M Essigsäure, 0,4 M NaCl) versetzt. Diese Lösung wurde 72 Stunden bei 4° C gerührt, anschließend mit 500 ml l M Tris-Lösung (ungepuffert) versetzt und mit 10 M NaOH zum Umschlagspunkt von Phenolrot neutralisiert.

Durch Zugabe von festem NaCl wurde eine Konzentration von l M NaCl eingestellt. Diese Lösung wurde zur vollständigen Extraktion der Kollagene bei 4° C über Nacht gerührt und anschließend zur Abtrennung von Zelldebris und Agarose zentrifugiert (JA 20,1, 28980 x g, 4° C, 30 min). Da frühere Studien (Shaffer, 1982; Bruckner et al., 1989) ergeben hatten, daß diese Fraktion kein nachweisbares Kollagen mehr enthält. Das Pellet wurde verworfen, und die Kollagene wurden durch Erhöhen der NaClkonzentration von 4,5 M NaCl ausgefällt. Dazu wurde festes NaCl in die Lösung gegeben (200 mg/ml).

Die Lösung ließ man für 4 Stunden bzw. über Nacht rühren. Die ausgefallenen Kollagene wurden abzentrifugiert (F2402, RPM 14000, 17530 x g, 20 min, 4°C). Das Pellet wurde in 300 μl Storage-Puffer (0,4 M NaCl, 100 mM Tris-HCl, pH 7,4) aufgenommen und in einem 2ml Eppendorf überfuhrt. Die Kollagene wurden mit 1700 μl Ethanol präzipitiert, abzentrifugiert (F2402, 17530 x g, 20 min, 4°C) und das Pellet in bidestilliertcs Wasser aufgenommen. Nach wiederholter Ethanolpräzipitation wurden die Kollagene in 100 μl Probepuffer aufgenommen. Die Kollagene wurden mit 5 μl Mercaptoethanol reduziert.

3.2.1.5 Die Bestimmung der Zellproliferation

Für die Bestimmung der Zellproliferation wurde nach bestimmten Zeitintervallcn dieselbe Stelle der Kulturschale (sichtbar gemacht durch einen kleinen Punkt am Boden der Petrischale) durch ein Phasenkontrastmikroskop vergrößert und fotografiert (Zeiss Axiowert)
10). Die Anzahl der Zellen auf den Aufnahmen (mindestens 100 Zellen) wurden über die ganze Kulturzeit verfolgt und durch Zählen bestimmt.

3.2.1.6 Nachweis der alkalischen Phosphatase

Der Nachweis der alkalischen Phosphatase wurde durch deren Reaktion von mit p- Nitrophenylphosphat erbracht (Bessey et al., 1946). Die Aktivität in den Medienüberständen blieb auch nach längerer Lagerung bei -20° C erhalten. 50 μl Aliquots des Medienüberstands im Eppendorfgefäß wurden mit 450 μl einer Reaktionslösung (0,2% p- Nitrophenylphosphat in Diethanolamin-HCl, pH 9,8) versetzt.
Im Brutschrank wurden die Ansätze bei 37° C für 30 min inkubiert und anschließend mit einer Stopplösung (2M NaOH, 0,2 mM EDTA) versetzt. Bei einer Wellenlänge von l = 405 nm wurde die Extinktion des gelben Reaktionsprodukts (P-Nitrophenol) bestimmt.

3.2.1.7 Elektrophorese, Autoradiographie, Western-Blot

i) Elektrophorese

Die im Probepuffer für 3 min bei 95° C denaturierten Proteine wurden auf Polyacrylamidgradientengelen elektrophoretisch getrennt (Laemmli, 1970). Zur Analyse der Kollagene wurden die Kollagen im Probepuffer (0,8 M Harnstoff, 10% (w/v) Gly-cerol, 2% (w/v) SDS, 0,001% (w/v) Bromphenol Blau, 0,1 M Tris-HCl, pH 6,8) aufgenommen und durch 4,5-15% Polyacrylamidgradientengelen getrennt. Die Anfärbung der Proteine erfolgte in einer wäßrigen Lösung mit 0,1% (w/v) Coomassie Brillant Blue R-250 in 25% (v/v) 2- Propanol, 10% (v/v) Essigsäure, die Entfärbung der Gele erfolgt in 10% (v/v) Essigsäure, 10% (v/v) Methanol.

ii) Autoradiographie (Bonner and Laskey, 1974)
Nach der Färbung mit Coomassieblau wurden die Gele für die Fluorographie vorbereitet, indem sie dreimal für je 15 Minuten in Dimcthylsulfoxid (DMSO) äquilibriert und danach für 2 Stunden in 20% (W/V) Diphenyloxazol (l DPO)/DMSO) getränkt wurden.
Die behandelten Gele wurden ausgiebig gewässert und anschließend ge trocknet.

Die Exposition der Gele erfolgte bei -80° C auf Kodak XAR-5 Röntgenfilmen.

iii) Imiminblot
Die elektrophoretisch aufgetrennten Proteine wurden im Immunblot auf eine Nitrocellulose-Membran elektrotransferiert (Towbin et al., 1979).

Dazu wurden das PA-GEGel und die Nitrocellulosemembran mit Filterpapieren und Schwammtüchern zwischen Gitter geklemmt und in einen Tank zwischen zwei Plattenelektroden getaucht, der mit Blotpuffer (50 mM Tris, 3580 mM Glycin, 0,1% (w/v) SDS, 20% (v/v) Methanol) gefüllt war. Bei einer Spannung von 30V und einer Stromstärke von 490 mA wurden die Proteine für 6 Stunden elektrotransferiert.

Soweit notwendig wurden transferierte Proteine auf der Membran mit 0,1% (w/v) Coomassie Blue R-250 in 40% (v/v) Methanol, 1% (v/v) Eisessig für l Minuten gefärbt und mit 50% (v/v) Methanol entfärbt. Die Blotmembran wurde zur Blockierung unspezifischer Bindungsstellen nach dem Transfer mit 2% Trockenmilchpulver in PBS behandelt und über Nacht bei 4°C unter Schütteln mit dem primären Antikörper in entsprechender Verdünnung in 0,5% Trockenmilchpulver in PBS inkubiert. Die Membran wurde nach mehrfachem Waschen mit PBS mit dem zweiten Antikörper gegen IgG des Kaninchens in 0,5% Trockenmilchpulver in PBS 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Immunreaktive Banden wurden nach intensivem Waschen mit einem Chemolumineszen/system oder unter Verwendung einer Substratlösung aus 0,18 mg/ml 4-Chlor-l-Naphtol und 0,04% H2O2 delektiert.

3.2.1.8 Elektronenmikroskopie

a) Präparation
Für elektronenmikroskopische Untersuchungen wurden die Agarosekulturen folgendermaßen vorbereitet: Ein Stück Kultur, bestehend aus Hoch- und Niedertemperaturagarose, wurde 4 Stunden lang bei 4°C in 3% Glutaraldehyd/ 0,1 M Natriumcacodylat pH 7,4 fixiert. Nach Waschen mit PBS pH 7,4 wurde es für l Stunde bei Raumtemperatur mit Osmium inkubiert und dann in einer aufsteigenden Alkoholreihe entwässert (15 min Leitungswasser, 15 min 70% EtOH, 15 Minuten 90% EtOH, 15 min 96% Ethanol, 2 x 25 min EtOH abs.). Danach wurde das Stück 2×15 min in Propylenoxid gelegt und dann über Nacht bei 4° C in ein Eponpropylenoxid-Gemisch gegeben. Nach Einbettung in Epon (3 Tage im Wärmeschrank bei ca. 65°C zur Polymerisierung) wurden Semidünnschnitte und Ultradünnschnitte am (Ultra)-Mikrotom angefertigt.

b) Elektronenmikroskopische Untersuchungen Das verwendete Transmissionselektronenmikroskop Zeiss EM902 ist ein TEM mit einem zwischen dem ersten und zweiten Projektivlinsensystem integrierten Castaing-Henry- Energiefilter.

Es hat ähnliche Abbildungseigenschaftcn wie ein konventionelles TEM mit den Vorteilen verbesserter Bildkontraste im Abbildungs- und Beugungs-Modus bei der sogenannten zero-loss Filterung. Hierbei wird in Näherung die chromatische Aberration durch Ausfilterung unelastisch gestreuter Elektronen unterdrückt und damit der Kontrast und die laterale Auflösung erhöht. Eine weitere Kontrastierung (z.B. mit Uranylazetat) und damit eine weitere Manipulation des nativen Zustands der Proben war daher nicht mehr notwendig. Parallel zur Morphologie wurde auch die strukturelle Ausprägung und Anordnung der ersten Mineralbildungen durch zero-loss gefilterte Elektronenfeinbereichsbeugung untersucht.
Durch die Tatsache, daß bei elektronenmikroskopischer Beugung eine sehr viel geringere Anzahl periodisch wiederkehrender atomarer Baugruppen im Kristallgitter zur Erzeugung elektronenmikroskopischer Beugungsreflexe gegenüber der Röntgenbeugung ausreicht, und durch 3 Material und Methoden 50 die Erhöhung des Kontrastes aufgrund der zero-loss Filterung, konnte die Anordnung und strukturelle Ausprägung der primären Kristallbildungen bei den Matrix-vesikeln weitgehend geklärt werden. (Mit Dank an Dr. U. Plate für die elektronenmikroskopischen Untersuchungen).

3.2.1.9 Der Gewinn von Osteoblasten-ähnlichen-Zellen

Die primären osteogenen Vorläuferzellen wurden aus Kälberpriost gewonnen. Hierzu wurde das Periostgewebe des Methacarpus frei präpariert und dann vorsichtig von Knochen abgelöst. Schmale Stücke mit einer Fläche von 0,5 x 1cm wurden geschnitten und mit der osteogenen Seite nach unten in Kulturschale (etwa 10 Stück proSchale) verteilt. Die Explantate wurden in DMEM mit 75/L Glutamin, 10% FKS, Penicillin 100 μg/ml, Streptomycin 100 μg/ml, unter Zusatz von 50 μg/ml Betaaminopropionitrite (BAPN), 50 μg/ml Ascorbat, 1 mM Cystein und 1 mM Pyruvat bei 37°C und 5% CO2 kultiviert. Das Medium wurde 1 x pro Wochen gewechselt. Nach 4 Wochen sind Osteoblasten-ähnlichen Zellen aus dem Perioststück ausgewachsen und können für weitere Versuche verwendet werden. Hierzu wurden die Zellen durch Inkubation mit Kollagenase und Tyrode-Lösung abgelöst, gesammelt und mit 500 g/min zentifugiert. Das so gewonnene Zellpellet wurde für weitere Untersuchungen eingesetzt. (Mit Dank an H, P. Wiesmann für den Gewinn der Osteoblasten-ähnlichen Zellen).

3.2.1.10 Die Kultivierung der Osteoblasten-ähnlichen-Zellen in Kollagen I-Gel

Für das Anlegen der Zellkulturen wurde eine Lösung von 5 mg/ml Kollagen I in 10 mM Salzsäure hergestellt. Diese Lösung wurde zur Sterilisation gegen 10 mM HCl mit 0,5% Chloroform dialysiert. Durch häufiges Redialysieren gegen 10 mM HCl wurde das Chloroform entfernt. Die Schalenböden wurden mit einer Trägerschicht bedeckt, die ebenfalls aus einem Kollagen I-Gel bestand. Dazu wurde die Kollagenlösung mit der gleichen Menge zweifach konzentrierten Mediums und einer entsprechenden Menge normalen DMEM gemischt, so daß eine Kollagenkonzentration von 1,2-1,25 mg/ml eingestellt wurde. In die Schalen wurden jeweils etwa 800 μl der Lösung pipettiert. Die Schalen wurden über Nacht im Brutschrank inkubiert, so daß sich ein festes Trägergel bildete.

Zum Anlegen der Kulturen wurde die Kollagenlösung mit der gleichen Menge zweifach konzentrierten DME Mediums gemischt. Dieser Lösung wurde die entsprechende Menge der Zellsuspension zugegeben, so daß die Zellzahl 2×106 Zellen/ml in der fertigen Suspension betrug. In jede Kulturschale wurden 800 μl der Suspension pipettiert. Die Kollagenkonzentration in der Gelmatrix betrug 1,2 oder 1,25 mg/ml. Die Kollagene ließ man im Brutschrank über Nacht zu einem festen Gel erstarren.

3.2.2 Gewebeuntersuchungen

3.2.2.1 Die Isolation von denaturierten Kollagenpolypeptide aus dem Rippenknorpel

2g Rippenknorpel wurde der von Perichondrium und anderem Fremdgewebe befreit, dreimal mit Krebspuffer gewaschen, in 0,3 mm dicke Scheiben geschnitten und in 20 ml 50 mM Tris, 4,5 M Guandinin, 5mM EDTA, 5mM Benzamid, 5mM N-Ethyl-Maleimide, pH 7,4 inkubiert. Danach erfolgt eine Homogenisation mit einem Polytron-Homogenisator.

Die entstehende Suspension wurde in einem 50 ml Falcontube bei 4° C geschüttelt. Nach 24 Stunden Schütteln wurde die Suspension zentrifugiert. Der Überstand der Rohkollagenlösung wurde dreimal gegen das 20-fache Volumen von DEAE-Puffer (2 M Harnstoff, 0,2 M NaCl, 0,1 M Tris-HCl, pH 7,4) dialysiert und anschließend auf 40 ml verdünnt. Nach dem Zentrifugieren (JA 30.50, 15000 rpm, 4° C, 15 min, 27200 x g) wurde 200 μl Kollagenlösung mit 1800 μl Alkohol bei 4°C 3 Stunden präzipitiert, abzentrifugiert (F2402, 17530 x g, 20 min, 4 °C) und das Pellet in bidestilliertes Wasser aufgenommen. Nach wiederholter Ethanolpräzipitation wurden die Kollagene in 100 μl Probepuffer aufgenommen. Die Kollagene wurden mit 5 μl Mecaptoethanol reduziert.

3.2.2.2 Elektronenmikroskopie

Der Knorpel wurde mit Krebspuffer gewaschen und von Perichondrium und Fremdgewebe befreit. Der so erhaltene Knorpel wurde dünn (ca. 0,3 mm) geschnitten und in 3% Glutaraldehyd/ 0,1 M Natriumcacodylat, pH 7,4 fixiert. Die weiteren Schritte erfolgten parallel zur bereits oben beschriebenen Elektronenmikroskopie der Agarosekulturen.

3.2.2.3 Präparation von säurelöslichem Kollagen I aus Kalbshaut

Bei -80 °C gelagerte, fötale Kalbshaut wurde auf Eis gestellt, in 5 cm breite Streifen geschnitten und unter Zugabe von gestoßenem Eis im Fleischwolf zerkleinert.
Die Haut wurde mit kaltem Wasser aufgeschlämmt und anschließend abzentrifugiert (JA 10, 17696 x g, 30 min, 4 °C). Das Pellet (270 g) wurde mit 111 M NaCl, 50 m M Tris-HCl, pH 7,4, 20 mM EDTA, 2 mM N-Ethylmaleinmid durch ein mechanisches Rührwerk extrahiert. Die Extraktionslösung wurde zentrifugiert (JA 10, 17696 x g, 30 min, 4 °C), und der Überstand der Neutralsalzextraktion wurde aufgehoben.
Das Pellet wurde mit 1500 ml 0,5 M Essigsäure versetzt und durch Rühren mit einem mechanischen Rührwerk extrahiert. Durch Zentrifugation (JA 10, 17696 x g, 30 min, 4 °C) wurde säurelösliches Kollagen im Überstand erhalten. Dieser Überstand (1500 ml) wurde durch langsames Einstreuen mit 78,9 g festem NaCl versetzt, sodaß eine Endkonzentration von 0,9 M NaCl erreicht wurde. Die Lösung ließ man zur vollständigen Fällung weitere 6 Stunden bei 4 °C rühren. Diese Lösung wurde zentrifugiert (JA 10, 17696 x g, 30 min 4 °C).
Das Pellet, das die Kollagene I, III und V enthält, wurde mit 3000 ml 0,5 M NaCl, 0,1 M Tris, pH 10,5 versetzt und mit dem Polytron homogenisiert. Das Homogenat wurde durch Zusatz von 2 ml 8 M HCL auf pH 7-8 gebracht und weiter gerührt. Die Lösung wurde zentrifugiert (JA 10, 17696 x g, 30 min, 4 °C).
Der Überstand (315 ml) wurde durch langsames Eintragen von 22,1 g festem NaCl in die Lösung auf eine Konzentration von 1,7 M NaCl gebracht. Die Lösung wurde über Nacht bei 4 °C gerührt, und anschließend wurden weitere 300 ml des Puffers mit 1,7 M NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,4 hinzugefügt. Die Lösung wurde zur Abtrennung von Kollagen III zentrifugiert.
Der Überstand wurde mit 1,7 M NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,4 auf das doppelte Volumen verdünnt und mit Eisessig auf pH 2-3 eingestellt. Die Lösung wurde durch Zentrifugation geklärt (JA 10, 17696 x g, 30 min, 4 °C). Diese Lösung wurde dreimal gegen 210,2 M Essigsäure dialysiert und anschließend lyophilisiert. Aus der Präparation wurden 1,7 g säurelösliches Kollagen I erhalten.

3.2.3 Zink-Bestimmung nach ICP-ms-Methode und DNA Bestimmung

Die aus dem Rippenknorpel isolierten zwei Millionen Zellen wurden erst im deionisiertem Wasser aufgenommen. 100 μl dieser Suspension (entspricht 200 Tausend Zellen) wurden für DNA-Bestimmung und 900 μl für die Bestimmung der Ionenzusammensetzung durch Inductively Coupled Plasma-mass spectrometry (ICP-MS) verwendet. Die ICP-MS hat Dr. Peter Quint in Institut für Medizinische Physik und Biophysik für uns durchgeführt.

3.2.3.1 Fluorimetrische DNA-Bestimmung

Die l00 μl Probe (etwa 200 Tausend Zellen) wurden in 1,4 ml l0 mM Tris/HCl, pH 7,0, 10 mM NaCl aufgenommen. Die Zellen wurden bei -80 °C eingefroren und nach 4 Stunden wieder aufgetaut. Die aufgetauten Zellen wurden noch weiter mit Ultraschall 5 Minuten behandelt und mit 0,2mg Bisbenzimid versetzt.
Je 10 μl der drei DNA-Standard(l) und 10 μl H2O (Leerwert) wurden mit 1,5 ml Farbstofflösung(2)versetzt. Im Fluorimeter wurden nach 5-60 Minuten mit einer Anregungswellenlänge von ca. 365nm die Emissionen der Ansätze im Bereich um 450nm gemessen.

Aus den Emissionen und Konzentrationen der Standards wurde eine Eichkurve erstellt, mit deren Hilfe die Konzentration der Proben ermittelt wurde.

Reagenzien:
1. DNA-Standards: l,5 μg/ml, 1 μg/ml, 0,5 μg/ml
2. Farbstofflösung: 0,2 mg Bisbenzimid (Hoechst 33258)/1 in 10 mM Tris/HCl, pH 7,0, l0 mM NaCl
3. Eichstandard für das Fluorimeter

4.1 Die Spätdifferenzierung der humanen Chondrozyten im Rippenknorpel

Gegenstand unserer Untersuchung waren die Präparation und die Kultivierung von humanen Chondrozyten in Agarose, die biochemischen und morphologischen Untersuchungen der humanen Chondrozyten und der Vergleich der humanen Chondrozyten mit den Hühnerchondrozyten, die aus dem 17d-embrynalen Sternum isoliert wurden. Am Anfang traten die im folgenden dargestellten Probleme auf, die zum größten Teil gelöst werden konnten.

4.1.1. Die Beseitigung der Probleme

4.1.1.1 Die Beschaffung des humanen Knorpels

Durch das Institut für Rechtsmedizin, das Institut für Anatomie und die Klinik und Poliklinik für Kinder- und Neugeborenenchirurgie der medizinischen Fakultät der Westfälischen Wilhelms-Universität Münster wurde uns humaner Knorpel zur Verfügung gestellt. Wir waren mit diesen Einrichtungen so organisiert, daß wir den Knorpel unmittelbar nach der Entnahme erhielten.

4.1.1.2 Die Präparation

Anfangs haben wir zwei Arten von mikrobiologischen Kontamination bei den Knorpelproben festgestellt, erstens eine oberflächliche Kontamination, die durch Sezernierung und Präparierung des Knorpels vorkommt, zweitens eine Kontamination der Chondrozyten selbst. Um eine oberflächliche Kontamination, auszuschließen bzw. zu beseitigen, haben wir folgende Maßnahmen ergriffen:

1) Bei der Entnahme des Knorpels und seiner weiteren Bearbeitung sollte möglichst steril
gearbeitet werden. So haben wir beispielsweise die verwendeten Geräte und das Entnahmegut ständig mit 70% Alkohol besprüht.
2) Nach der Entnahme der Gewebe ist der Knorpel von anderen Geweben bedeckt. Um die oberflächliche Kontamination zu beseitigen legten wir die Probe daher für 10 Minuten in 70% Alkohol und wuschen sie danach zweimal gründlich mit Krebspuffer.Die Kontamination der Chondrozyten konnte nicht beseitigt werden, so daß diese Proben für die Studie unbrauchbar waren.
Die Effiziens der Verdauung des Knorpels und die Zellausbeute sind von den folgenden Faktoren abhängig:

1. vom Alter der Patienten
2. von der Dicke der Schnitte
3. von der Menge der Kollagenase B

Daher sollte nur Knorpel von weniger als 10 Jahre alten Patienten oder Probanden verwendet werden, sollte der Knorpel möglichst dünn geschnitten werden, und betrug die Konzentration von Kollagenase B mehr als 1,5 mg/ml.

4.1.1.3 Die Zellzahl

Wir haben Knorpel von Patienten aus verschiedenen Altersgruppen erhalten. Wie die Daten der Tabelle l zeigen, konnten aus den Knorpeln älterer Patienten in Bezug auf die Masse der Probe weniger Chondrozyten isoliert werden.
Zu Beginn wurde die Durchführung dadurch behindert, daß nicht genug Chondrozyten aus dem Gewebe zu isolieren waren. Aus diesem Grund gab es einige Experimente, deren Ergebnisse in der Tabelle l aufgeführt sind. Um eine vernünftige Methode zur Isolierung der Chondrozyten zu finden, haben wir zuerst von einem Entnahmegut je 2 Gramm Knorpel genommen und die Chondrozyten danach unterschiedlich isoliert. Die effektivste Vorgehensweise ist im Abschnitt „Material und Methode” beschrieben.

Alter Die Anzahl der Zellen /2g Gewebe
3 Jahre 8,000,000
5 Jahre 8,500,000
8 Jahre 6,200,000
10 Jahre 5,600,000
14 Jahre 3,000,000
16 Jahre 1,500,000
17 Jahre 1,500,000
21 Jahre 1,000,000
Tabelle 1: Die Anzahl / 2g Rippenknorpel der isolierten Zellen unterschiedlich alter Patienten

4.1.1.4 Die Vitalität

Während wir die Chondrozyten vom fötalen epophysären Knorpel kultiviert haben, haben wir eine verminderte Vitalität festgestellt. Daher haben wir schließlich nur noch Rippenknorpel verwendet.

4.1.1.5 Antikörper gegen Kollagen X

Wir verwendeten ein lyophylisiertes Kaninchenantiserum gegen recombinantes humanes Kollagen X, das wir von Prof. von der Mark erhalten haben und im Immunblot in der Konzentration von 0,33 g/ml – l  g/ml eingesetzt haben. Während der Arbeit haben wir festgestellt, daß dieser Antikörper außerdem noch mit Kollagen IX reagiert. Daher haben wir, wie im Abschnitt „Material und Methode” beschrieben, die Kollagene nach der Pepsin4 verdauung reduziert und alkyliert. Auf diese Weise ließ sich die gegen Kollagen X gerichtete Antwort des Antiserums spezifisch identifizieren und im Immunblot von derjenigen gegen Kollagen IX unterscheiden.

4.1.2 Untersuchung der terminalen Differenzierung in humanen Chondrozyten aus Rippenknorpel

4.1.2.1 Induktion der terminalen humanen Chondrozytendifferenzierung durch Serumkomponenten

i) Einfluß unterschiedlicher Konzentrationen von FKS (Fötales Kälberserum)
Bruckner et al, (1989) und Tschan et al, (1990) wiesen nach, daß 10 % FKS die volle Kaskade der Spätdifferenzierung bei Hühnerchondrozyten induziert, d. h. die Zellen proliferieren zuerst, das Volumen nimmt zu, und schließlich wird Kollagen X synthetisiert.
Daher stellte sich zunächst die Frage, ob dies auch bei humanen Chondrozyten von Rippenknorpel zu beobachten ist und ob 0.1 % oder l % FKS im Medium ebenfalls ausreichend für die Induktion der Differenzierung sind. Die Proliferation der Chondrozyten konnte durch Zählen einzelner Zellen auf repräsentativen Fotografien bestimmt werden, die nach verschiedenen Zeitintervallen von einer identischen Stelle der Zellkulturschalen gemacht wurden. Wie die Abbildung 4.12 zeigt, ist diese Methode am Anfang der Kulturperiode (bis 28 Tage) gut anwendbar, wogegen es später (nach 4-5 Wochen) zur Zellaggregation kommt, was die Zählung einzelner Zellen schwierig macht. Die Kollagensynthese wurde qualitativ nach der Pepsinverdauung mit anschließender Kollagenextraktion aus der Zell-Agaroseschicht mit SDS-PAGE bestimmt. Zur genaueren Bestimmung von Kollagen X wurde zusätzlich ein Immunblot mit lyophylisiertem Anti.
recomb. Human Kollagen X Serum durchgeführt. Dieses Kollagen X, das Auftretenden der Aktivität von alkalischer Phosphatase und die Induktion der Proliferation, gekoppelt mit einer erhöhten Matrixproduktion, gelten als biochemische Marker der terminalen Chondrozytendifferenzierung. Bei Kultivierung der humanen Chondrozyten mit 10 % FKS nahm neben der erhöhten Proliferation (Abb.4.14) und der gesteigerten Kollagensynthese (Abb.4.21) auch die Größe der Zellen zu (Abb.4.12M-P). Übereinstimmend mit dieser morphologisch sichtbaren Vergrößerung des Zellvolumens wurde unter den pepsinresistenten Kollagenen auch Kollagen X gefunden (Abb.4.17). Zusätzlich war Aktivität der alkalischen Phosphatase nachweisbar (Abb.4.16). Unter dem Elektronenmikroskop konnte das Abschnüren von Matrixvesikeln von den Chondrozyten im Extrazellulärraum beobachtet werden (Abb.4.23). Die anschließende Mineralisierung dieser Matrixvesikel wurde durch energiegefilterte transmissionelektronenmikroskopische Feinbereichs-Beugungsaufnahmen (SAESD) als apatitisches Mineral nachgewiesen. Dabei wurden die charakteristischen Gitternetzebenenabstände (d-Werte) des Hydroxylapatits (d002 =0.344 nm, d300=0.273 nm, etc.) mit den d-Werten von Hydroxylapatit aus der Röntgenbeugungskartei (ASTM-932) verglichen und identifiziert (Abb. 4.23b,c).
Wie in Abb. 4.12 zu sehen ist, induzieren Konzentrationen von 0,1 % und l % FKS im Gegensatz zu einem Gehalt von 10 % FKS im Medium nicht die Proliferation. 1% FKS stimuliert jedoch die Synthese von Kollagen II und XI pro Schale (Abb. 4.21). Die Zellgröße (Abb. 4.12 I-L) nimmt nur leicht im Vergleich zur serumfreien Kontrolle (Abb. 4.12 A-D) zu.
Hinsichtlich der anderen Marker ist weder Kollagen X (Abb.4.17) noch die alkalische Phosphatase-Aktivität (Abb.4.16) feststellbar. Wir gehen davon aus, daß bei einer Konzentration von 0,1 % und l % FKS nicht genügend Faktoren enthalten sind, um die terminale Differenzierung auszulösen. Um zu klären, welche Komponenten im fötalen Kälberserum für das Auftreten der terminalen Chondrozytendifferenzierung verantwortlich sind, mußte nun die Reaktion der Knorpelzellen auf die einzelnen Bestandteile des FKS betrachtet werden. Um diese Komponenten zu gewinnen, konnte entweder das Serum aufgetrennt oder auf Faktoren, deren Vorkommen im FKS bekannt ist, zurückgegriffen werden.
Für unsere Untersuchungen entschieden wir uns für die letztere Möglichkeit.
ii) Regulation der Chondrozytendifferenzierung durch isolierte Faktoren in serumfreier Zellkultur
Um die Regulation der terminalen Differenzierung zu studieren, ist es unerläßlich, in serumfreien Zellkulturen zu arbeiten. Durch das in unserem Labor erarbeitete serumfreien Kultursystem für Hühnerchondrozyten, in dem durch Zugabe von Antioxidantien (z. B. l mM Cystein) in voll definiertem Medium (DMEM) die Chondrozyten über lange Zeit vital bleiben und das auch auf humane Chondrozyten anwendbar ist, war es möglich, die Chondrozyten serumfrei zu kultivieren und die Effekte einzelner Signalmoleküle auf die Synthese des Kollagen X ohne Überlagerung mit anderen Serumfaktoren hin zu untersuchen.
Als wichtigste Wachstumsfaktoren, die getestet wurden, sind Thyroxin, Insulin, insulinähnliche Wachstum-Faktoren (IGF) und das C- und N-terminale Segment (#1-34 und #53-84) des Parathormons (PTH) zu nennen. IGF I ist seit 1957 (Salmon & Daughaday) als Sulfatierungsfaktor im Serum bekannt, Insulin gilt als wichtiger anaboler Stimulus im Fötus (De Pablo et al., 1985; Girbau et al., 1988), und Schilddrüsenhormon (Thyroxin, Trijodthyronin) ist für Wachstum und Entwicklung des Skelettes unentbehrlich (Lebvitz & Burch, 1975). In serumfreier Organkultur konnte außerdem gezeigt werden, daß Thyroxin am Reifungsprozeß der Chondrozyten beteiligt ist (Burch & Lebovitz, 1981 & 1982).
In einem Gemisch der gesamten Chondrozyten eines Sternums eines 17-tägigen Hühnerembryos konnte die terminale Differenzierung durch Thyroxin eingeleitet werden (Böhme et al, 1992). In unserer Agarosekultur stimulierten IGF I (100 ng/ml), Insulin (100 ng/ml) und Thyroxin (50 ng/ml) die terminale Differenzierung der Chondrozyten vom Rippenknorpel nicht.
Es sind weder Kollagen X (Abb.4.17) und alkalische Phosphatase (Abb.4.20) noch Proliferation (Abb.4.15) und Mineralisation nachweisbar gewesen, auch nicht nach längerer Kultivierungszeit. Allerdings fanden wir eine Stimulation der Synthese der Kollagene II und XI (Abb.4.21).
In vivo führt die Injektion von Parathyroidhormon (PTH) zu einer Stimulation des Knorpelwachstums (Havelken et al., 1979; Gunnes & Hock, 1984). Bereits innerhalb der Nebenschilddrüse, wie auch extraglandulär (u. a. Leber, Niere), wird PTH einem partiellen Fragmentierungsprozeß unterzogen, welcher hauptsächlich zur Entstehung dreier Fragmente (#) führt: #1-34, #28-48, #53-84 (die Zahlen entsprechen den Sequenzabschnitten des PTHMoleküls).
Neuere Studien belegen multiple Wirkspektren von PTH an Aorta, Gehirn, Haut, glatter Muskulatur, Leber, Knorpel und anderen Organen durch die zusätzliche Bioaktivität der ursprünglich als inaktiv geltenden „Spaltprodukte #28-48 und #53-84. Allerdings herrscht über die Struktur-Funktionsweise dieser mittleren Terminale und der C-Terminale Unklarheit.
Da zudem die PTH-Wirkungen nicht nur durch das „klassische” N-tereminale Fragment #1- 34 vermittelt wird, sondern sich das Spektrum durch die Aktivitäten der anderen PTHSpaltprodukte (#28-48, #53-84) erweitert, sollte die vorliegende Untersuchung als biochemische Vergleichsanalyse der bisher kaum untersuchten Wirkungen der Fragmente am Knorpel dienen. Der Nachweis wurde mit serumfreien Zellkultur-Studien mit humanen Chondrozyten aus Rippenknorpel auf der Ebene der Proliferation, der Kollagensynthese und der Aktivität der alkalischen Phosphatase geführt.
In Kulturen, die eine Konzentration von 10-8 M PTH-Spaltprodukte (#1-34 und #53- 84) enthielten, zeigte sich nach 21 Tagen keine Proliferation (Abb. 4.13). In Kulturen mit einer Zelldichte von 1,5 x 106 Zellen/ml wurde nach 48-stundiger Behandlung mit 10-8 M PTH (1-34) oder 10-8 M PTH (53-84) die Synthese von Kollagen X beobachtet (Abb.4.22).
Ähnlich wurde nach Gabe von PTH (53-84) die Produktion der ALP-Aktivität nach 12 Tagen nachweisbar. Diese erhöhte sich bis zu Tag 21 (4.20). Die alkalische Phosphatase wurde nach 12 Tagen nur durch das C-Terminal des PTH induziert. Bis zum 21. Tag erhöhte sich die Aktivität der alkalischen Phosphatase (Abb.4.20).

4.1.3 Gewebeuntersuchungen

4.1.3.1 Mineralisierung, alkalische Phosphatase und Kollagen

X als Marker für die Spätdifferenzierung in humanem Rippenknorpel Humaner Rippenknorpel, d. h. der knorpelige Anteil der Rippen zwischen knöchernem Teil und Sternum, bleibt bis zur Pubertät Knorpelgewebe. Obwohl er als hyaliner Knorpel bezeichnet wird, ist er vaskularisiert. Bereits postnatal oder spätestens am 17.
Lebenstag ist das Knorpelgewebe von arteriellen und venösen Gefäßen durchzogen. Sie dringen in den Knorpel vom Perichondrium ausgehend zentripetal und sorgen durch mediale Verzweigungen für eine gute Versorgung des Gewebes mit Blut. Durch zunehmendes Dickenwachstum werden die zentral liegenden Chondrozyten durch Diffusion nicht mehr ausreichend ernährt, weshalb diese Zellen vermutlich angiogene Faktoren freisetzen, die die Vaskularisierung induzieren, damit ihre Versorgung wieder gewährleistet ist (N. Nuss, 1990). Im Rahmen der normalen Alterung setzt am Ende der Pubertät teilweise eine Mineralisation und Ossifikation des Rippenknorpels ein (Helly, 1929; Fischer, 1954). Diese Osteogenese kann auch als degenerativer Prozeß betrachtet werden, der eine Folge mangelhafter Versorgung der zentral liegenden Chondrozyten sein könnte (Fischer, 1954; Sames, 1977; Sames & Wöbet, 1980). Nach histochemischen Untersuchungen des Knorpels der ersten Rippe von Kindern und Erwachsenen wurde kein Kollagen X, nach der Pubertät jedoch alkalische Phosphatase nachgewiesen (Classen et al., 1995).
Um die Spätdifferenzierung im Rippenknorpel festzustellen, haben wir Rippenknorpel extrahiert und Kollagen X und alkalische Phosphatase-Aktivität biochemisch identifiziert.
Dazu wurde Kollagen X mit 4.5 M Guanidin / HCl (pH 7,4) aus dem Knorpelgewebe isoliert. Im Immunblot mit Kaninchenantiserum gegen Kollagen X wurde dann Kollagen X mit einem Molekulargewicht von 52 kDa in verschieden alten Knorpeln nachgewiesen (Abb. 4.19). Nachdem wir Kollagen X in den Knorpeln identifiziert hatten, erwarteten wir dort ebenfalls alkalische Phosphatase zu finden. Die aus dem Gewebe extrahierte alkalische Phosphatase wurde mit p-Nitrophenolphosphat für 30 min. bei 37°C inkubiert und die Extinktion bei 405 nm photometrisch bestimmt. So konnten wir im Knorpelgewebe von Spendern vor der Pubertät keine alkalische Phosphatase nachweisen. Bei 17-, 27-, 32-, 36-, 37- und 52-jährigen Spendern war eine Aktivität der alkalischen Phosphatase messbar (Abb. 4.18). Wir vermuten daher, daß die alkalische Phosphatase erst nach der Pubertät im Knorpelgewebe synthetisiert wird. Da die alkalische Phosphatase und Kollagen X Marker für die terminale Differenzierung sind, haben wir angenommen, daß sich nach der Pubertät auch eine Mineralisation des Knorpels zeigt. Glutaraldehydfixiertes Gewebe wurde im Elektronenmikroskop untersucht. In Geweben, in denen die alkalische Phosphatase nachweisbar war, konnte auch eine Mineralisierung festgestellt werden (Abb. 4.24a).

4.1.3.2 Ossifikation in humanem Rippenknorpel

Wie beschrieben haben wir Mineralisierung, ALP-Aktivität und Kollagen X als Marker für die Spätdifferenzierung in humanem Rippenknorpel nach der Pubertät festgestellt.
Daher erwarteten wir, daß dieses Gewebe ossifiziert wird. Bei einem 37-jährigen Mann konnten wir daraufhin eine Ossifikation in EM-Schnitten beobachten (Abb.4.24b). Aufgrund dieser Feststellung gehen wir davon aus, daß der humane Rippenknorpel nur teilweise ossifiziert.
Diese Vermutung ist konsistent mit der Folgerungen des Arbeitens von Koebke und Saternus, 1982 & 1985).

4.1.4 Abbau von Kollagen X

Wie in der Einleitung bereits erwähnt, besitzt Kollagen X zwei Imperfektionen der tripelhelikalen Sequenz mit der Aminosäureabfolge (Gly-X-Y-Z-A), die durch die Kollagenase abgespalten werden (Welgus et al., 1990). Im Gegensatz zu den durch die Kollagenase abgespaltenen Fragmenten der übrigen Kollagentypen wird das 32-KDa- Fragment des Kollagens X bei 37°C nicht sofort weiter abgebaut (Gadher et al., 1990).
Nach 45 Tagen konnte dieses Fragment auch in unseren Kulturen nachgewiesen werden (Abb.4.17).

Abb.4.12: Die Entwicklung von Rippenknorpelchondrozyten in Vitro Phasenkontrastlichtmikroskopische Aufnahme von Zellen unter Zugabe von 0,l %igen KKS (E-H), l %igen FKS (I-L), 10 %igen FKS (M-P). Kontrollzellen (A-D) wurden nur mit DMEM kultiviert.
Die Aufnahmen wurden nach 7 Tagen (A,E,I,M), 14 Tagen (B,F,J,N), 21 Tagen (C,G,K,O), und 28 Tagen (D,H,L,P) wiederholt Die identische Stelle der Zellkulturschalen wurde durch ein Phasenkontrastmikroskop vergrößert und fotografiert. (Zeiss Axiovert 10) Es werden repräsentative Stellen gezeigt.

Abb.4.13: Die Entwicklung von Chondrozyten des Rippenknorpels in in Vitro Phasenkontrast.
Lichtmikroskopische Aufnahme von Rippenchondrozyten in der Agarosekultur unter Zugabe von 100 ng/ml IGF1 (E-H), 100 ng/ml Insulin (I-L) 50 ng/ml Thyroxin (M-P), C-Terminal von PTH (Q-T)und N-Terminal von PTH (U-X).
Kontrollzellen (A-D) wurden nur mit DM KM kultiviert.
Die Aufnahmen wurden nach 7 Tagen (A,E,I,M,Q,U), 14 Tagen (B,F,J,N,R,V), 21 Tagen (C,G,K,O,S,W), 28 Tagen (D,H,L,P,T,X) in Kultur genommen.
Die identische Stelle der Zellkulturschalen wurde durch ein Phasenkontrastmikroskop vergrößert und fotografiert (Zeiss Axiovert 10). Es werden repräsentative Stellen gezeigt.

4. Proliferation der Chondrozyten in serumhaltiger Zellkultur Tage in Kultur Abb.4.14: Zellproliferation unter der Wirkung von DMEM und verschiedenen Konzentration von FKS (alle oben beschrieben).
Die Zunahme der Zellzahl entspricht dem Bruchteil der Zellen, die auf einem Feld in der Kulturschale nach den angegebenen Kulturzeiten gezählt wurden, relativ zu den am ersten Kulturtag an derselben Stelle beobachteten.
Proliferation der Chonldrozyten in serumfreier Zellkultur Tage in Kultur Abb.4.15: Zellproliferation unter Wirkung von DMEM und verschiedenen Serumfaktoren (alle oben beschrieben).
Die Zunahme der Zellzahl entspricht dem Bruchteil der Zellen, die auf einem Feld in der Kulturschale nach den angegebenen Kulturzeiten gezählt wurden, relativ zu dem am ersten Kulturtag an derselben Stelle beobachteten.

Tage in Kultur Abb. 4.16: Die Aktivität der alkalischen Phosphatase im Kulturmedium der Rippenknorpelchondrozyten, die mit DMEM Medium und verschiedenen Konzentrationen von FKS kultiviert wurden.
Die Aktivität wurde anhand des Umsatzes des synthetischen Substrats (P Nitrphnol) photometrisch bestimmt.
Abb. 4.17 Immunblot pepsinierter und reduzierter Kollagene aus Chondro-zytenkulturen von Rippenknorpel, die in Agarose in 21 Tagen mit DMEM (Bahn 1), 0,1% FKS (Bahn 2), 1% FKS (Bahn 3), 100 ng/ml IGF, (Bahn 4), 100 ng/ml INS (Bahn 5), 50 ng/ml Thyroxin (Bahn 6), 10% FKS (Bahn 7) und in 45 Tagen mit 10% FKS (Bahn 8) kultiviert wurden.

A.P. Aktivität im Gewebe 0 3 8 11 17 27 32 36 37 52 Alter / Jahre
Abb.4.18: Die Aktivität der alkalischen Phosphatase wurde nach Extraktion der Gewebe (Rippenknorpel) mit Triton durch die Bildung von Nitrophenol bestimmt.
Abb.4.19 Immunblot zum Nachweis von Kollagen Typ X nach Extraktion der Kollagene aus Rippenknorpel (20 mg) in 4,5 M Guanidin. Es handelt sich hierbei um Gewebeproben von 3 Jahre (Bahn 1), 11 Jahre (Bahn 2), 17 Jahre (Bahn 3) und 37 Jahre (Bahn 4) alten männlichen Probanden.  Kollagen Typ X (52 kDa)

A.P. Aktivität/ Schale Tage in Kultur Abb. 4.20: Die Aktivität der alkalischen Phosphatase im Kulturmedium der Rippenchondrozyten, die mit DMEM Medium und verschiedenen Serumfaktoren (oben alle beschrieben) kultiviert wurden.
Die Aktivität wurde anhand des Umsatzes des synthetischen Substrats P-Nitrophenolat gemessen. Die Konzentration des gelb gefärbten Reaktionsprodukts (P-Nitrophenolat) wurde photometrisch bestimmt.

Abb. 4.21: Das Gel (Bahne 1-7) zeigt die Coomasie-Blau-Färbung der synthetisierten Pepsin-resistenten Kollagene, die durch SDS-PAGE (4,5-15
%) aufgetrennt wurden. Die Zellen wurden in DMEM (Bahn 1), 0,1 % FKS (Bahn 2), 1% FKS (Bahn 3), DMEM+100ng/ml IGF1 (Bahn 4),
DMEM+100ng/ml INS (Bahn 5), DMEM+50ng/ml Thyroxin (Bahn 6) und 10% FKS (Bahn 7) bei einer Zelldichte von 1,5 Mio Zellen /ml in Agarose
kultiviert.
Abb. 4.22: Immunblot pepsinierter und reduzierter Kollagene aus Chondrozytenkulturen von Rippenknorpel, die in Agarose 48 Stunden mit DMEM (Bahn 1), 10-8 M N-terminales Fragment von PTH (#1-34) (Bahn 2) und 10-8 M C-terminales Fragment von PTH (#53-84) (Bahn 3,4) kultiviert wurden.
4 Ergebnisse 71
(a) M: 44.000 x
(b) M: 12000 x

Abb.4.23 Matrixvesikel-Mineralisierung in humaner Chondrozyten-Kultur

(a) Abschnürung eines MV vom Chondrozyten (zero-loss gefilterte ESI-Aufnahme)
(b) Mineralisierung eines MV (zero-loss gefilterte ESI-Aufnahme)
(c) Feinbereichsbeugung des mlnerallsierten MV (zero-loss gefilterte ESD-Aufnahme)

Die elektronenmikroskopischen Aufnahme wurden freundlicherweise von Dr. U. Plate zur Verfugügung gestellt.

Abb. 4.24: Mineralisierung und Ossifikation von humanem Rippenknorpel
(a) mineralisierter MV im Rippenknorpel
(b) Ossifikation im Rippenknorpel
Die elektronenmikroskopischen Aufnahme wurden freundlicherweise von Dr. U. Plate zur Verfügung
gestellt.

4.2 Zinkmangel in Trichterbrustchondrozyten

Funktion, Transport und Speicherung von Zink wurden bereits in der Einleitung ausführlich besprochen. Wie beschrieben, ist die Prokollagen-N-Protease ein Metalloenzym, das wahrscheinlich im endoplasmatischen Retikulum posttranslational modifiziert und danach an die Zelloberfläche sezerniert wird. Dort spaltet es das aminoterminale Propeptid von Prokollagen ab. Das Ergebnis dieses Prozessierungsschnittes ist die Entstehung von entweder Kollagen II oder pC-Kollagen, das teilweise prozessierte Prokollagen II, welches das C-terminale Propeptid noch enthält.
In der vorliegenden Arbeit haben wir eine Aktivitätsändening der Prokollagen-NProtease in Chondrozyten aus Knorpel von Trichterbrustpatienten verschiedenen Alters in Abhängigkeit von der Zinkkonzentration in der Kulturmedien nachweisen können. Die
Aktivität der Prokollagen-N-Protease wurde durch den Grad der Prozessierung von pNKollagen II bestimmt.

4.2.1 Biochemische Analyse

Als Operationsmaterial von kostaler Knorpel wurde in der Klinik für Kinderchirugie der WWU durchgeführten Korrekturoperationen von Trichterbrustdeformitäten erhalten.
Normales Rippenknorpel von Spendern vergleichbaren Alters stammte aus dem Institut für Rechtsmedizin. Chondrozyten wurden aus Rippenknorpel isoliert und in Agarose
eingebettet. Die Agarosekulturen wurden serumfrei in Medien mit Zink und ohne Zink kultiviert. Nach erfolgter Kultur wurden die Zellen metabolisch mit [14C]-Prolin markiert und die neu produzierten Kollagene durch Elektrophorese und Fluo-rographie quantitativ erfaßt.

4.2.1.1 Nachweis von pN-Kollagen II

Ein Teil der neusynthetisierten Kollagenmoleküle wird n icht in die denovo gebildete
M a t r ix d er C ho nd ro z y ten in Ag a ro s e k u l tur e in ge b a ut un d d if fun d ie rt d e sh a lb in d ie Kulturmedien. Prokollagen II tritt dort unter normalen Umständen als vollständig zu Kollagen II prozessiertes Material auf. In der SDS-Gel-Elektrophorese der radioaktivmarkierten Medienproteine tritt deshalb die al(II)-Kette mit einem Molekulargewicht von 95kDa auf. Ein Teil des Proteins erscheint jedoch als pN-al(II)-Ketten, die eine etwas geringere elektrophoretische Mobilität besitzen und deren Menge davon abhängig, wie stark Prokollagen II durch die Prokollagen-N-Protease prozessiert wird. Chondrozyten von Trichterbrustpatienten wurden in Agarose eingebettet. Nach 20 Tagen in Kultur wurden die Kollagene aus den Medien extrahiert. Danach wurden die Kollagene mit und ohne vom fötalen Kalb stammenden Prokollagen-N-Protease in 50mM Natrium Cacodylat-Puffer pH 7,5 200mM KCl, 2mM CaCl, 2,5 NEM, 0.5mM PMSF, und 0,02% Brij 16 Stunden bei 26 °C inkubiert. Nach 16 Stunden Inkubation wurde die Reaktion mit 50 ml EDTA-Lösung (0,2M EDTA, PH 8, 0,5% SDS, 0,5M DTT) gestoppt und die Kollagene einer SDSGelelektrophorese unterzogen. Wie die Abbildung 4.25 zeigt, verschwand die Bande x oberhalb von Kollagen II durch Inkubation der Kollagene mit der Enzym. Die Bande x (Abb. 4.25) entspricht somit pN-Kollagen II. Durch die Inkubation mit der PN-Peptidase wurde das pN-Kollagen II in Kollagen II prozessiert.
Abb. 4.25: Konversion von pNKollagen durch die Prokollagen- N-Protease. SDS-Gelelektrophorese der Medienproteine mit (+) und ohne (-) vorangegangene Behandlung mit dem Enzym.
Darstellung der Polypeptide: Coomassie-Blau

4.2.1.2 Nachweis des Effekts von Zink auf die Prozessierung von Kollagen II

Zur Darstellung des Effekts von Zinkionen auf die in Agarose kultivierten Trichterbrustchondrozyten diente die Aktivität der Prokollagen-N-Protease. Diese wiederum wurde über den Grad der Prozessierung von Kollagen II ermittelt. Chondrozyten wurden zuerst aus dem Trichterbrustsknorpel isoliert und in Agarose eingebettet. Danach wurden die in der Agarose eingebetteten Chondrozyten mit Zink (DMEM + 15 mmol ZnSO4) und ohne Zink (nur DMEM) serumfrei kultiviert. Das Medium DMEM enthält kein Zink.
Die Kulturen mit und ohne Zink wurden nach 20 Tagen in Kultur mit [14C]-Prolin über 48 Stunden markiert. Die markierten Kollagene der Kulturmedien wurden zur Herstellung eines Fluorogramms verarbeitet.
In der unten stehenden Abbildung des Fluorogramms ist die pN-Kollagen II-Bande oberhalb der Kollagen II-Bande (Bahn l). Durch Zugabe von Zink wurde pN-Kollagen II
verstärkt zu Kollagen II prozessiert (Bahn 2). Dieses Phänomen beweist einen Effekt von Zink auf die Prozessierung von Kollagen II.
Abb. 4.26 zeigt die Verstärkung der Prozessierung von pNKollagen II durch Zugabe von Zink (15 mM ZnSO4) in serumfreien Kulturen (nur mit DMEM). Die Kulturen mit Zink
(DMEM + 15 mM ZnSO4) Bahn (1) und ohne Zink (DMEM) Bahn (2) wurden nach 20 Tagen in Kultur mit [14C]-Prolin während 48 Stunden markiert.
Darstellung der Polypeptide: Fluorogramm Alter: 7 Jahre

4.2.1.3 Die Verstärkung des Effekts von Zink durch 100 ng/ml Insulin

Insulin ist als ein wichtiger anaboler Stimulus in der Fötalentwicklung bekannt (De Pablo et al. 1988; Hill 1978). Es gibt nach unseren heutigen Erkenntnissen keine
Informationen darüber, daß Insulin den Effekt von Zink auf die Prozessierung von Prokollagene verstärkt. Trichterbrustchondrozyten wurden 4 Kulturbedingungen ausgesetzt:
mit Zink (DMEM + 15 mmol ZnSO4), ohne Zink (DMEM),
mit Insulin und Zink (DMEM + 100 ng/ml Insulin + 15 mmol ZnSO4) und Insulin ohne Zink (DMEM + 100 ng/ml Insulin)
Die Kulturen wurden nach 20 Tagen in Kultur mit [14C]-markierten Prolin während 48 Stunden inkubiert und metabolisch die markierten Kollagene im Kulturmedium durch SDSGelelektrophorese und Fluorographie nachgewiesen. Wie die Abbildung 4.27 des Fluorogramms zeigt, wird die Prozessierung von Kollagen II durch Zugabe von Insulin und Zink verstärkt.
Abb. 4.27 zeigt die Verstärkung des Effekts von Zink auf die Prozessierung durch Zugabe von 100 ng/ml Insulin. Die Zellen wurden mit DMEM (Bahn 1), DMEM + 15 mM Zink (Bahn 2), DMEM + 100 ng/ml Insulin (Bahn 3) und DMEM + 100 ng/ml Zink
(Bahn 4) kultiviert und nach 20 Tage mit [14C]- Prolin über 48 Stunden
markiert.
Darstellung der Kollagene: Fluorogramm
Alter: 6 Jahre

4.2.1.4 Vergleich des Effekts von Zink auf Trichterbrustchondrozyten und kostalen

Chondrozyten von normalen Spendern

Wir haben an den Trichterbrustchondrozyten gezeigt, daß Zink einen Effekt auf die
aminoterminale Prozessierung von Prokollagen II hat. Wir nehmen an, daß die
herabgesetzte Prozessierung von pN-Kollagen II entweder mit einem Zinkmangel in den
Trichterbrustchondrozyten oder der ungenügenden Aktivität der Prokollagen-N-Protease in Verbindung steht.
Deswegen haben wir den Effekt von Zink auf kostalen Chondrozyten von normalen
Spendern untersucht. Wir haben die Chondrozyten aus Rippenknorpel eines
vergleichbaralten normalen Spenders (5 Jahre alte Junge) isoliert, in Agarose eingebettet und mit Zink (DMEM + 15 mmol ZnSO4) und ohne Zink (DMEM) kultiviert. Nach 20 Tagen wurden Kulturen mit [I4C]-Prolin während 48 Stunden markiert und die markierten Kollagene zur Herstellung eines Fluorogramms verarbeitet. Wie Abbildung 4.28 zeigt, hat sich die Prozessierung von pN-Kollagen II durch Zugabe von Zink in der Agarosekultur nicht verändert.
Weil die Zugabe von Zink in die Kulturmedien keinen Einfluß auf die Prozessierung
von Prokollagen II hat, können wir schließen, daß gesunde Chondrozyten normaler Spender ausreichend Zink enthalten, um die Produktion von aktiven Enzym auch während der gesamten Kulturzeit zu gewährleisten und Prokollagen-N-Protease in gesunden Chondrozyten normal ist.
Abb. 4.28 zeigt, daß Zink keinen Effekt auf die Prozessierung von Prokollagen II in kostalen Chondrozyten von normalen Spendern hat. Die Zellen wurden mit DMEM (Bahn 1) und DMEM + 15 mM Zink (Bahn 2) kultiviert und nach 20 Tage mit [14C]-Prolin während 48 Stunden markiert.
Darstellung der Kollagene: Fluorogramm
Alter: 5

4.2.2 Laborchemische Analyse

Zwei Untersuchungskollektive sind gebildet worden. Das Kollektiv I (Normalkollektiv)
war aus vier Rippenknorpelproben zusammengesetzt, die im Institut für Rechtsmedizin
von Probanden entnommen wurden, die keine Trichterbrust aufwiesen und die durch einen Unfall ums Leben kamen.

Das Alter dieser Personen lag zwischen 4 und 10 Jahren. Das Kollektiv II wurde von vier weiteren Knorpelproben gebildet, die bei einer Operation zur Trichterbrustkorrektur Kindern im Alter von 2,5 bis 7 Jahren entnommen wurden. Aus diesen Gewebeproben wurden die Chondrozyten gewonnen. Zur Bestimmung des Gehalts dieser Zellen an Zink, Kalzium und Kupfer durch Inductively Coupled Plasma-Mass Spectrometry (ICP-MS) und des Gehalts an DNA wurden jeder Probe 2 Millionen Zellen entnommen. Diese wurden in einem 15-ml-Falcon-Tube mit l ml deionisiertem Wasser lysiert. 100 ml dieser Suspension wurden für die DNA-Bestimmung und 900 ml für die Bestimmung der Ionenzusammensetzung verwendet. Die Ergebnisse der Proben 1-4 (in mg/Kg=ppm) wurden nach den Doppelbestimmungen mit (sn) bezogen auf 900mL Ausgangslösung in pMol/Zelle umgerechnet. Das Gesamt-DNA-Gewicht der normalen Chondrozyten und der Trichterbrustchondrozyten war in etwa gleich. Dieses zeigt zusammen mit der Zellzahlbestimmug, daß gleich viele Zellen von normalen Chondrozyten und Trichterbrustchondrozyten für diese Untersuchung verwendet worden sind.
Spurenelementanalytische Untersuchungen von Trichterbrustknorpel (Rupprecht et al.,
1987) ergaben einen hoch signifikanten Zinkabfall bei gleichzeitig erhöhtem Calciumgehlt gegenüber einem gesunden Kontrollkollektiv. Wir schließen aus unserer  aborchemischen Analyse das gleiche Ergebnis.

Die statistische Überprüfung der einzelnen Werte für den Gehalt an Zink, Kalzium und
Kupfer in kostalen Chondrozyten von Trichterbrustpatienten zeigt einen signifikanten
Mangel an Zink und Kupfer. Im Vergleich zu kostalen Chondrozyten von normalen
Probanden ist die Konzentration dieser Ionen etwa halb so groß. Dagegen war der Gehalt an Kalzium mehr als doppelt so hoch. Proben-Nr.
Angabe der Standardabweichung (sn-1), bezogen auf 900 mL Die Isotope 66Zn, 65Cu und 44Ca wurden bestimmt, da z.B. dieses Zn-Isotop bei den vorhandenen Ca-Konzentrationen nicht gestört wird. Durch P. Quint (1998) wurde beschrieben, daß alle Zn-Isotope bei hoher Ca-Konzentration und 63Cu durch ein Ar- Na-Molekülion gestört werden (P. Quint und K.D. Richter 1996).
Die laborchemische Analyse wurden freundlicherweise von Dr. P. Quint zur Verfügung gestellt.

4.2.3 Die Ursache von Zinkmangel in Trichterbrustchondrozyten

Wir haben biochemische und physikalische Hinweise erhalten, daß in Trichterbrustchondrozyten die Zinkionen-Konzentration erniedrigt ist. Warum die Trichterbrustchondrozyten weniger Zink enthalten, wissen wir allerdings nicht. Um die Ursachen des Zinkmangels in Trichterbrustchondrozyten zu finden, haben wir verschiedene Überlegungen angestellt. So sehen wir als Ursachen für den Zinkmangel in Trichterbrustchondrozyten im Vorfeld drei Möglichkeiten:
i) Störung der Zinkaufnahme
ii) Störung der Zinkspeicherung
iii) Störung des Zinktransports in der extrazellulären Matrix oder über die Plasmamemberan der Chondrozyten hinweg

Es ist zu bemerken, daß die nachfolgenden Ergebnisse nur für freie Zinkionen in vitro
definierten Agarosekultur gelten.

4.2.3.1 Störung der Zinkaufnahme

Wir haben im Rahmen des biochemischen Nachweises ausführlich über den Zinkeffekt
gesprochen. Dabei haben wir herausgestellt, daß Zink einen Einfluß auf die Prozessierung
von Prokollagen II hat. Da das der Agarosekultur zugegebene Zink über die Prokollagen-NProtease einen Einfluß auf die Prozessierung von Prokollagen II nimmt, können wir davon
ausgehen, daß freie Zink in den Chondrozyten aufgenommen wird und an Prokollagen-NProtease gebunden wird.

4.2.3.2 Störung der Zinkspeicherung

Zink kommt intrazellulär wahrscheinlich nicht in freier Form gebunden vor, sondern vorzugsweise an einem Trägerprotein, wie Metallothionein. Unser Ziel war es daher, durch die folgende Untersuchung eine Zinkspeicherung in den Chondrozyten nachzuweisen, um die Hypothese einer diesbezüglichen Störung verwerfen zu können. Aus isolierten Trichterbrustchondrozyten wurden Agarosekulturen vorbereitet und nach folgender Methode unterschiedlich mit oder ohne Zink kultiviert: Zwei Schalen wurden am ersten Tag für 48 Stunden mit Zink (DMEM + 100 ng/ml Insulin + 15 mmol ZnSO4) inkubiert (Abb. 4.29 Bahn 1,2). Nach dreimaligem Waschen mit DMEM wurden diese bis zum 20. Tag des Experiments ohne Zink mit (DMEM + 100 ng/ml Insulin) kultiviert und anschließend für 48 Stunden mit [I4C]-Prolin markiert. Zwei weitere Schalen wurden nach 20 Tagen Kultivierung mit DMEM 100 ng/ml Insulin zunächst mit Zink (15 mmol Zinksulfat) inkubiert und dann mit l mCi/ml C14-Prolin für 48 Stunden markiert (Abb. 4.29 Bahn 3,4).
Die markierten Kollagene aller Schalen haben wir zur Herstellung eines Fluorogramms weiterverarbeitet.
Wir sehen keinen Unterschied in Bezug auf die Prozessierung von Prokollagen II zwischen Kulturen, die am Anfang mit Zink inkubiert wurden, und solchen, bei denen dies erst nach 20 Tagen geschah. Aus diesem Ergebnis schließen wir, daß das im Medium von
Agarosekulturen zugegebene Zink unter diesen Bedingungen innerhalb von 48 Stunden in die Trichterbrustchondrozyten aufgenommen oder/und an Zellmembran gebunden und dort gespeichert werden kann.

4.2.3.3 Störung des Zinktransports in der extrazellulären Matrix der Trichterbrustchondrozyten

Es ist noch nichts Näheres darüber bekannt, in welcher Form Zink im extrazellulärem Raum transportiert wird. Im Serum bindet sich Zink an Albumin und bildet mit diesem eine Transportform, die im Blut zirkuliert. Ob Zink als Ion oder zusammen mit einem Protein als Transportprotein in die extrazelluläre Matrix transportiert wird, wissen wir nicht. Ebenfalls unbekannt ist, wie lange das Zink braucht, um die extrazelluläre Matrix zu passieren und die Zellen zu erreichen. Ein Aspekt unserer Überlegung war, wie der Transport von Zink in die extrazelluläre Matrix nachzuweisen sei. Dafür haben wir dünn geschnittene Trichterbrustknorpel zu je 2 g einmal in einer Schale als Trichterbrustknorpelgewebe mit Zink (DMEM + 100 ng/ml Insulin + 15 mM ZnSO2) inkubiert. Nach 10 Tagen wurden die Chondrozyten aus dem Gewebe isoliert und im gleichen Medium (DMEM + 100 ng/ml Insulin) in Agarose kultiviert. Nach 5 Tagen wurden die Zellen in Agarosekultur mit [1 4C]-Prolin markiert und eine der Kulturen wurde zusätzlich mit 15 mM Zink inkubiert Abb.4.29 Bahn l und 2 entsprechen DMEM + 100 ng/ml Insulin + 15 mM Zink (die Inkubation mit Zink im ersten und zweiten Tag der Kultivierung) Bahn 3 und 4 entsprechen DMEM + 100 ng/ml Insulin + 15mM Zink (die Inkubation mit Zink nach 20 Tagen der Kultivierung)
Darstellung: Fluorogramm
Alter: 5 Jahre
pN-Kollagen II
Kollagen II

(Abb. 4.30 Bahn 1). Die markierten Kollagene wurden zur Fluorographie vorbereitet. Wie das untenstehende Fluorogramm zeigt, wurde keine Prozessierungsänderung beobachtet, obwohl die Chondrozyten im Gewebe vorher mit Zink inkubiert waren (Abb. 4.30 Bahn 3 und 4). Bezüglich der Prozessierung von Prokollagen II zeigen diese Chondrozyten keinen Unterschied zu den Zellen, die im Gewebe nicht mit Zink (Abb. 4.30 Bahn 2) inkubiert waren. Aus diesem Resultat läßt sich die Vermutung ableiten, daß freie Zn-Ionen innerhalb von 10 Tagen nicht durch die extrazelluläre Matrix von Trichterbrustchondrozyten diffundieren können. Wir wissen aber nicht, in welcher Form Zink in extrazellulären Matrix transportiert wird.
Abb.4.30 Bahn 1: Die Trichterbrustchondrozyten
wurden erst im Knorpel 10 Tage mit Zink inkubiert. Sie wurden dann aus dem Gewebe isoliert und weiter in Agarose kultiviert.
Nach 5 Tagen wurden die Zellen für 48 Stunden mit [14C]-Prolin markiert und gleichzeitig mit 15 mM Zink inkubiert.
Bahn 2: Die Chondrozyten wurden erst im Knorpel 10 Tage ohne Zink inkubiert. Sie wurden dann aus dem Gewebe isoliert und weiter in Agarose kultiviert. Nach 5 Tagen wurden die Zellen für 48 Stunden mit 14C-Prolin markiert.
Bahn 3 und 4: Die Chondrozyten wurden erst im Knorpel 10 Tage mit 15mM Zink inkubiert. Sie wurden dann aus dem Gewebe isoliert und weiter in Agarose kultiviert. Nach 5 Tagen wurden die Zellen für 48 Stunden mit 14C-Prolin markiert.
Darstellung: Fluorogramm
Alter: 8 Jahre
pN-Kollagen II
Kollagen II

4.3 Die Differenzierung der Osteoblasten-ähnlichen Zellen in dreidimensionaler Matrix

Die Zellkulturtechniken, um Cytophysiologie und Cytobiochemie der Osteoblasten und deren Vorgänger zu studieren, sind vielfältig (Sodek und Berkman 1987; Majeska 1996). Kultursysteme, die Osteoblasten oder Osteoblasten-ähnlichen Zellen enthalten, sind für einige Spezies und verschiedene Hartgewebe etabiliert oder leiten sich von bestimmten Zellpopulationen auf der Line von osteogenen Vorläuferzellen ab.
Die Parameter für das prinzipielle Erstellen der Kulturen (d.h. Zusammensetzung des Mediums, Typus und Konzentration des Serums, Temperatur, Antibiotika) und die Methode ihrer Aufrechterhaltung (d.h. Ernährungsfrequenz, Isolation und Trennung, Arten der Kultivierung) sind sowohl in primären Kulturen mit einer minimalen Anzahl von Subkulturen oder Passagen, als auch in langlebigen permanenten Zellinien sehr verwandt.
Viele Primärsysteme repräsentieren an Osteoblasten reichhaltige Zellkulturen, nachdem sie aus Knochen der fötalen oder neugeborenen Nagetiere und anderer Spezies, inklusive des Menschen, isoliert wurden. Calvarien (Yeh et al. 1996; Naci et al. 1996; Chaudhari et al. 1997; Herbert et al. 1997; Lomri et al. 1997; Schirrmacher et al. 1997) sind besonders günstig, da ihre externen und internen Kortikalplatten einfach von dem Knochenmark zu trennen sind. Bei bisherigen Kulturen von osteogenen Vorlauferzellen gewinnt man Zellen aus harter Knochensubstanz, aus Periost oder aus Knochenmark (Nichols and Puleo 1997; Fromigue et al. 1998; Klein et al. 1998) oder aus embryonalen mesenchymalen Vorläuferzellen des Knochengewebes (Ong et al. 1998). Die Kultursysteme der permanenten Zellinien benutzen menschliche Osteosarcoma-Zellinien (Okamoto et al. 1998; Yellowley et al. 1998), untransformierte klonale Zellinien, wie die Maus-Calvariea entstammt der MC3T3-E1 Line 8 (Beck et al. 1998), und experimentelle unsterbliche Zellinien (Harris et al. 1995).

Im Gegensatz zu den oben genannten Zellkultursystemen, die mit zweidimensionalen gleichmäßigen Monolayern arbeiten, sind dreidimensionale Zellkultursysteme entwickelt worden, um eine poröse Matrix zu liefern, damit es möglich wird, daß Knochenzellen adherieren und in diesem System wachsen. Das verwendete Biomaterial bewegt sich zwischen synthetischen Polymeren (Attawia et al. 1995; Laurencin et al. 1996; Saat et al. 1998), bioaktiven Gläsern (El-Ghannam et al. 1997) und natürlichen Biomaterialen wie Kollagenen Schwämmen (Schoeters et al. 1992), denaturierten Schwämmen (Casser-Bette et al. 1990) und reinen Knochenmineralien (Tsuang et al. 1997). Da diese dreidimensionalen Kultursysteme sehr dicht sind, ist es nicht möglich, sie lichtmikroskopisch während der Kultivierung zu verfolgen. Eine weitverbreitete Kulturtechnik ist ein Gelkultursystem, welches das dreidimensionale Netzwerk der Proteoglycan-Polymere simuliert (Horwitz and Dorman 1970; Benya and Shaffer 1982).
Die primären periostalen osteogenen Vorläuferzellen sind multipotent, d.h. sie sind
auch in der Lage, in Chondrozyten zu differenzieren. Es bleibt jedoch unklar, ob sie diese
Eigenschaft auch nachträglich behalten, wenn sie in vitro bereits zu Osteoblasten-ähnlichen Zellen differenziert worden sind. In dieser Arbeit werden wir diese Frage beantworten und zusätzlich beschreiben, welchen Einfluß die verschiedenen Kultursysteme auf die Differenzierung von Zellen haben. Wir werden die Osteoblasten-ähnlichen Zellen biochemisch und morphologisch in verschiedenen Kultursystemen untersuchen.

4.3.1 Die Gewinnung von Osteoblasten-ähnlichen Zellen

Die osteogenen Vorläuferzellen der Periost vom Rind wurden für etwa 4 Wochen in einem adhäsiven Zustand (zweidimensionale Monolyerkulturen) zusammen mit fötalem Rinderserum kultiviert. Früher ist gezeigt worden, daß die Zellen in so einem Kultursystem konfluent sind und morphologisch wie Osteoblasten aussehen (Jones et al., 1991).
Außerdem synthetisieren sie die Proteine wie alkalische Phosphatase, Osteocalcin, Osteonectin und Kollagen I. Diese differenzierten Osteoblasten-ähnlichen Zellen werden in folgende Kultursysteme transferiert und biochemisch und morphologisch untersucht.

4.3.2 Die Kultivierung von Osteoblasten-ähnlichen Zellen in adhärenten Monolayerkulturen

4.3.2.1 Morphologische Untersuchungen

i) Lichtmikroskopische Untersuchung
Die nach vier Wochen im Monolayer-Kultur-System differenzierten Osteoblastenähnlichen Zellen wurden in Monolayerkultur passagiert. 5×105 in Monolayerkultur passagierten Osteoblasten-ähnlichen Zellen wurden mit 10% FKS kultiviert. Sie prolifederen und werden in der Zeit (etwa nach zwei Woche) konfluent. Die Zellen haben eine polygonale Form und bilden Fortsätze, durch die Zell-Zell-Kontakte gebildet werden (Abb. 4.31).
Zellfortsätze Abb. 4.31: Die lichtmikroskopische Aufnahme von Osteoblasten-ähnlichen Zellen in Monolayerkultur nach einer Wochen: Die Zellen wurden mit 10% FKS kultiviert und zeigen in einer Woche Fortsätze.

ii) Elektronenmikroskopische Untersuchung
Im Elektronenmikroskop werden ebenfalls langgestreckte Zellen beobachtet, die mit Nachbarzellen in Kontakt kommen. In der zytoplasmatischen Zusammensetzung sind sie ähnlich wie die Osteoblasten (gut entwickeltes rauhes endoplasmatisches Reticulum und ungewöhnlich lange Lysosome und Phagolysome) (Abb. 4.32).
Abb. 4.32 Die elektronenmikroskopische Aufnahme von Osteoblasten-ähnlichen Zellen in Monolayer-Kultur nach zwei Wochen: Die Zellen auf Monolayer-Schale wurden fixiert. Für die elektronenmikroskopische Aufnahme wurden Semidiinnschnitte angefertigt, die mit Uranylacetat fixiert sind. Die Zellen sind langgestreckt ähnlich der Osteoblasten mit gut entwickeltem rauhem endoplasmatischem Retikulum und ungewöhnlich lange Lysosome und Phagolysolysome.
Die Kontrastierung: 6000x
Die elektronenmikroskopische Aufnahme wurden freundlicherweise von Dr. T. Szuwart zur Verfügung gestellt.

4.3.2.2 Biochemische Untersuchungen

i) Kollagen-Synthese der Osteoblasten-ähnlichen Zellen in Monolayer-Kultur
Nach 14 Tagen haben wir die Kollagene mit [14C]-Prolin markiert. Die markierten Kollagene haben wir aus dem Medium extrahiert und zu einem Fluorogramm weiterverarbeitet.
Wie wir auf diesem Fluorogramm sehen (Abb. 4.35, Bahn 2), synthetisieren die Osteoblasten-ähnlichen Zellen drei Kollagene (Kollagen I, III, V).
Die obere Bande verschwindet nach Reduktion mit ß-Mercaptoethanol, welches charakteristisch für Kollagen III ist.
Lysosome und Phagolysome Osteoblasten-ahnhchen Zellen Nukleoli Fndoplasmatische Reticulum Boden der Schale

ii) Nachweis der alkalischen Phosphatase-Aktivität
Die Produktion von alkalischer Phosphatase nahm stark zu, stieg aber nicht kontinuierlich im Zeitraum von 2 Wochen (Abb. 4.36). Dies ist auch für authantische Osteoblasten
charakteristisch.

4.3.3 Die Kultivierung von Osteoblasten-ähnlichen Zellen in Agarose

4.3.3.1 Morphologische Untersuchungen

i) Lichtmikroskopische Untersuchung
Die Osteoblasten-ähnlichen Zellen wurden für 4 Wochen in Monolayer kultiviert, von der Schale durch Kollagenase-Behanlung abgelöst. 2×106 Zellen wurden in Agarose eingebettet und mit 10% FKS kultiviert. Unter dieser Bedingungen sehen die Zellen kugelförmig ähnlich der Chondrozyten aus. Im Gegensatz zu Monolayerkulturen beobachtet man weder Proliferation noch die Bildung von Zellfortsätze (Abb. 4.33).
Abb. 4.33: Lichtmikroskopische Aufnahme von Osteoblasten-ähnlichen Zellen in Agarose in zwei Woche: 2xl06 Zellen wurden in Agarose eingebettet und mit 10% FKS kultiviert. Die Zellen sehen unter dieser Bedingung ähnlich der Chondrozyten.

ii) Elektromiskroskopische Untersuchungen
Im Elektronenmikroskop zeigen die Zellen die typischen ultrastrukturellen Merkmale von Chondrozyten aus differenzierten Knorpeln (Bruckner et al., 1989). Einige dieser Merkmale sind die kugelförmige Gestalt und Kerne mit einem oder mehreren auffälligen Nuklei.
Abb. 4.34: Die elektronenmikroskopische Darstellung von Osteoblasten-ähnlichen Zellen in zwei Wochen in Agarosekulturen: die Zellen wurden in Agarose fixiert. Für elektronenmikroskopische Aufnahme wurde Semidünnschnitte angefertigt, die mit Uranylacetat kontrastiert sind. Die Zellen sind kugelförmig ähnlich der Chondrozyten und zeigen Kerne mit einem oder mehreren Nuklei.
Kontrastierung: 9.000 x
Die elektronenmikroskopische Aufnahme wurden freundlicherweise von Dr. T. Szuwart zur Verfügung gestellt.

4.3.3.2 Biochemische Untersuchungen

i) Kollagen-Synthese der Osteoblasten-ähnlichen Zellen in der Agarose-Kultur

Nach 14 Tagen wurden die Kollagene mit metabolisch [14C]-Prolin markiert, pepsiniert, aus dem Medium extrahiert und zur Fluorographie verabeitet. Wie aus dem Fluorogramm ersichtlich ist, synthetisieren die Osteoblasten-ähnlichen Zellen in Agarose Nuklei Kollagen II, jedoch kein Kollgen X, I (Abb. 4.35 Bahn 3). Durch die Markierung von pepsiniertem Kollagen II in einem Immun-blot mit monokolonalen Antikörpern gegen Kollagen II läßt sich die Anwesenheit von Kollagen II in Agarose-Kultur bestätigen.
Kollagen II ist ein Merkmal von Chondrozyten (Abb.4.35 Linie 4). Die Zellen synthetisieren keine Kollagene I und III, die Merkmale von Osteoblasten und mesenchymalen Vorläuferzellen sind.
Abb. 4.35: Die Darstellung von Kolljagen-Synthese der Osteoblasten-ähnlichen Zellen in der Monolayerkultur (Bahn2) und Agarosekultur (Bahn 3,4) im Vergleich zu Standard (Bahn 1). Die Zellen in Agarosekultur synthetisieren Kollagen II.

ii) Nachweis der alkalischen Phosphatase-Aktivität
Die nach Kultur in Agarose phenotypisch modulierten Periostalzellen produzieren keine Aktivität der alkalischen Phosphatase. Daher haben die Zellen unter diesen Kulturbedingungen Osteoblasten-ähnlichen Eigenschaften aufgegeben.
Abb. 4.36: Die alkalische Phosphatase-Aktivität der Osteoblasten in verschiedenen Matrices: Die Aktivität der alkalischen Phosphatase von Zellen in Kollagen I-Gel steigt in ersten Tagen kontinuierlich. In Agarosekultur zeigen die Zellen keine Aktivität der alkalischen Phosphatase

4.3.4 Die Kultivierung von Osteoblasten-ähnlichen Zellen im Kollagen IGel

4.3.4.1 Morphologische Untersuchung

i) Lichtmikroskopische Untersuchung
Die 2×106 Osteoblasten-ähnlichen Zellen, die 4 Wochen in Monolayer kultiviert waren, wurden abgelöst und in Kollagen I-Gel weiter mit 10% FKS kultiviert. Nach 2 Wochen Kultivierung sehen die Zellen polygonal aus und entwickeln Fortsätze, durch die die Zellen miteinander in Kontakt kommen. Die Zellen bilden wie die Osteoblasten eine netzartige Struktur und proliferieren.

Abb. 4.37: Lichtmikroskopiscbe Aufnahme von Osteoblasten-ähnlichen-Zellen in Kollagen I-Gel nach zwei Wochen. Die Zellen sind gestreckt ähnlich der Osteoblasten und bilden die Fortsätze.
Die Kultivierung: mit 10% FKS Zellzahl: 2×106 Zellen
ii) Elektronenmikroskopische Untersuchung
In elektronenmikroskopischer Untersuchung sehen wir langgestreckte Zellen, die aufgrund ihrer breiten Ausdehnung und ihrer Fortsätze mit den Nachbarzellen in Kontakt kommen. Hinsichtlich ihrer zytoplasmatischen Zusammensetzung sind sie ähnlich wie die Osteoblasten.
Abb. 4.38 Elektronenmikroskopische Aufnahme von Osteoblasten-ähnlichen-Zellen in Kollagen I-Gel in zwei Wochen: Die Zellen in Kollagen I-Gel wurden fixiert. Für elektronenmikroskopische Aufnahme wurde Semidünnschnitte angefertigt, die mit Uranylacetat fixiert sind. Die elektronenmikroskopische Aufnahme wurden freundlicherweise von Dr. T. Szuwart zur Verfügung gestellt.

4.3.4.2 Biochemische Untersuchungen

i) Kollagen-Synthese der Osteoblasten-ähnlichen Zellen in Kollagen I-Cel
2×106 Zellen wurden in Kollagen I eingebettet und mit 10% FKS kultiviert. Nach 14 Tagen haben wir die Kollagene mit [14C]-Prolin markiert. Die pepsinresistenten und markierten Kollagene wurden zu einem Fluorogramm weiterverarbeitet. Wie das Fluorogramm (Abb. 4.39) zeigt, synthetisieren die Zellen Kollagen I und V. Bemerkenswert ist, daß die Zellen in Kollagen I-Gel im Gegensatz zu Monolayer-Kulturen kein Kollagen III synthetisieren.
Abb.4.39 Die Kollagen-Synthese von Osteoblasten-ähnlichen-Zellen in Monolayerkultur (Bahn 3) und Kollagen I-Gel (Bahn 2) im Vergleich zum Standard (Bahn 1). Die Zellen wurden in Kollagen I-Gel eingebettet und mit 10% FKS kultiviert. Die Zellen in Kollagen I-Gel synthetisieren kein Kollagen III (Bahn II).
ii) Nachweis der alkalischen Phosphatase-Aktivität
Die Produktion alkalischer Phophatase wurde stark stimuliert. Die Zellen produzieren am 1. Tag alkalische Phophotase. Die alkalische Phosphatase-Aktivität nimmt während dieser Zeit zu. Somit zeigen die Zellen ein wesentliches Merkmal von Osteoblasten.